ניתוח ביטוי אונקוגנים עם שינויים ב-pH בקו תאי צינור הלבלב

מחקר זה מתאר פרוטוקול לבחינת ההשפעות של שינוי pH על ביטוי אונקוגן באמצעות ניתוח RNA-seq של קו תאי צינור הלבלב.

הגורם הרביעי המוביל למוות הקשור לסרטן, אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC), הוא בעל שיעור הישרדות של 12% לחמש שנים. למחלה זו יש פרוגנוזה גרועה והיא מאופיינת במיקרו-סביבה סטרומלית נוקשה, המהווה אתגר מוחשי בטיפול בה. לחולי דלקת לבלב כרונית יש סיכון גבוה פי 10 לפתח PDAC; בחולים אלה, ה-pH הצינורי יורד מ-pH 8.0 ל-pH 6.0 עקב אי ספיקת ביקרבונט והסביבה הדלקתית. מטרתנו הייתה להבין את תפקידה של הסביבה החומצית שנצפתה בדלקת לבלב כרונית על ביטוי אונקוגן בקו תאי צינור הלבלב.

לכן, 80% תאי אפיתל צינור לבלב אנושי הודגרו ב-pH 6.0 עד pH 7.2 למשך 6 שעות. סך ה-RNA מהתאים עובד כדי להעשיר את סך ה-mRNA בדגימות. ביטוי הגנים הוערך באמצעות ריצוף הדור הבא (NGS) של שכפולים ביולוגיים. ניתוח RNA-seq בוצע בעזרת כלי מקוון, וזוהו הגנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי (FCs < ± 2.0); היו 90, 148 ו-109 גנים מווסתים ו-20, 14 ו-23 גנים מווסתים ב-pH 6.0, 6.5 ו-7.0, בהתאמה. ארבעה אונקוגנים היו מווסתים ב-pH 6.0, שבעה היו מווסתים ב-pH 6.5 ושבעה היו מווסתים ב-pH 7.0. הגנים הנפוצים שהיו מווסתים ב-pH 6.0, pH 6.5 ו-pH 7.0 היו חלבון-טירוזין קינאז ספציפי לתאי לימפוציטים (LCK) [pH 6.0, FC: 2.93; pH 6.5, FC: 2.93; pH 7.0, FC: 3.32], פרוטו-אונקוגן FGR, טירוזין קינאז ממשפחת Src (FGR) [pH 6.0, FC: 4.17; pH 6.5, FC: 5.25; pH 7.0, FC: 5.09], ו-ArfGAP עם תחום SH3, אנקירין חוזר, ותחום PH 3 (ASAP3) [pH 6.0, FC: 2.37; pH 6.5, FC: 3.84; pH 7.0, FC: 2.51]. הסביבה החומצית מעוררת הפעלה של פרוטו-אונקוגנים, מה שעלול לעורר התחלת גידול בדלקת לבלב כרונית.

אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) היא אחד מסוגי הסרטן הראשוניים ומדורגת במקום הרביעי מבין סוגי הסרטן מבחינת מספר מקרי המוות הקשורים¹. שיעור תמותה גבוה יותר ניכר בקרב חולי PDAC, ועל פי מחקרים אחרונים, שיעור ההישרדות לחמש שנים הוא 12% בלבד. חולים עם דלקת לבלב כרונית מתועדת, מחלה הגורמת לדלקת בלבלב², הם בעלי סיכוי גבוה יותר (בערך פי 15-16) לפתח PDAC³. ישנם סוגים שונים של שיתוק מוחין עם אטיולוגיות שונות, כגון CP 4 הקשור לאלכוהול, תורשתי ואידיופט. ידוע כי התנאים הקיימים במהלך CP מובילים להיווצרות אבנים מסויידות, התפתחות תאים סרטניים ואפילו סוכרת. השכיחות של PDAC גבוהה בחולים עם דלקת לבלב כרונית תורשתית⁵.

מצבים פיזיולוגיים מסוימים בלבלב של חולי CP עשויים להועיל להתחלת מחלות אחרות; אלה כוללים את הסביבה הדלקתית, אנזימי עיכול פעילים וה-pH החומצי של מיץ הלבלב⁶. מגוון רחב של מחקרים מתבצעים בתחום הדלקת, שכן דלקת יוצרת כאוס בתפקוד התקין של האיבר ^7,8,9. עם זאת, חוסר איזון בוויסות ה-pH הוא תופעה נוספת שעלולה לעורר את התחלת הצמיחה הבלתי מבוקרת של תאים¹⁰. מיץ הלבלב של אנשים בריאים הוא אלקליין, המסייע לנטרל את הכימה החומצית המיוצרת על ידי הקיבה. לעומת זאת, מיץ הלבלב נשאר חומצי בחולי CP בגלל הפרשת ביקרבונט לא מספקת. רמות נמוכות של ביקרבונט אינן יכולות לנטרל לחלוטין את המיץ, מה שגורם לסביבה מעט חומצית בתוך צינור¹¹.

מחקרים קודמים מצביעים על כך שתאי סרטן מסתגלים ומשגשגים בסביבות חומציות¹². במקרים כאלה, מצבים הקיימים בתהליך של דלקת לבלב כרונית מרמזים על סביבה נוחה להתפשטות וגרורות של תאים אלה¹³. לפיכך, המחקר שלנו נועד להעריך את השינויים המורפולוגיים בתאי צינור הלבלב האנושיים ולהעריך ביטוי אונקוגן בתנאים מעט חומציים.

1. החייאת קו התאים

1. רכשו את קו תאי צינור הלבלב הרגיל האנושי (HPDEC / H6C7) והחיו את התאים במדיום טרי.
   1. הפשירו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
   2. הכינו טרי מדיום שלם וסננו אותו באמצעות פילטר מזרק.
      הערה: מדיום שלם מכיל את מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS).
   3. מוסיפים 6 מ"ל מהמדיום השלם לצינור חרוטי טרי של 15 מ"ל, מוסיפים את תרחיף התאים המופשר ומערבבים אותו היטב.
   4. צנטריפוגה המתלה ב -1,800 × גרם למשך 6 דקות. השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו 1 מ"ל של מדיום תרבית לגלולה וערבבו בעדינות.
      הערה: מדיום תרבית מכיל DMEM עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% אנטיביוטיקה של עט/סטרפטוקוקוקוק.
   5. הוסף את התאים טיפה לבקבוק T-25 המכיל 4 מ"ל של מדיום תרבית ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.

2. שינוי ה-pH של מדיום התרבות

1. הכן 100 מ"ל של תמיסות מלאי חיץ נתרן פוספט 0.5 M עם ערכי pH של 6.0, 6.5 ו-7.0 כאמור בטבלה 1.
2. בדוק את ה-pH עם מד pH והתאם אותו באמצעות 1 N HCl/1 M NaOH.
3. עקר את המאגרים במכסה זרימת אוויר למינרי עם מסנן מזרק של 0.45 מיקרומטר.
   הערה: ניתן לאחסן את המאגר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
4. הכן אמצעי תרבית עם ערכי pH של 6.0, 6.5 ו-7.0 על ידי הוספת 20 מ"ל של מאגר נתרן פוספט סטרילי 0.5 M עם ה-pH המתאים ל-80 מ"ל של מדיום תרבית.
5. הוסף את המדיה עם ה-pH השונה לתאי צינור הלבלב האנושיים המשולבים של 85-90%, ובדוק את השינויים המורפולוגיים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר במרווחים של שעה למשך 6 שעות.

3. בידוד RNA

הערה: יש להשתמש בכפפות סטריליות לבידוד RNA מהתאים ויש לטהר את המשטח באמצעות 100% אתנול.

1. הסר את מצע התרבות ושטוף את התאים במי מלח חוצץ פוספט (PBS).
2. מניחים את הצלחת על קרח, מוסיפים PBS לבאר ואז מגרדים את התאים בעזרת מגרד תאים.
   הערה: כמות ה- PBS שנוספה אמורה להספיק בכדי לכסות את התאים לגירוד. אין צורך להוסיף נפח גבוה של PBS.
3. אוספים את התרחיף בצינור טרי ומצנטריפוגה בחום של 8,000 × גרם למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
4. הוסף מאגר ליזה המכיל β-מרקפטואתנול לגלולה ופיפטה אותו למעלה ולמטה למשך 5-10 דקות על קרח.
5. הוסף נפח שווה של 70% אתנול לליזאט וערבב היטב. אין מערבולת.
6. הוסף את התמיסה לעמוד קרום הסיליקה, צנטריפוגה ב->8,000 × גרם למשך 30 שניות, והשליך את הזרימה דרך.
7. הוסף מאגר כביסה לדגימה וצנטריפוגה ב->8,000 × גרם למשך 30 שניות. צנטריפוגה את הצינור הריק למשך דקה אחת בטמפרטורה של >8,000 × גרם.
8. הוסף 30-50 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז לעמוד והשאיר אותו למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה של העמוד ב->8,000 ×גרם למשך 5 דקות.
   הערה: ניתן לאחסן דגימות RNA בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

4. RNA-seq/טרנסקריפטום

1. הערכת תקינות RNA
   1. בדוק את תקינות ה-RNA בביו-אנלייזר על ידי נטילת 1 מיקרוליטר (25-500 ננוגרם) וערבוב עם 5 מיקרוליטר של מאגר צבע.
   2. מערבל את התמיסה בחום של 500 × גרם למשך דקה אחת וסובב בקצרה.
   3. הפעל תגובת שרשרת פולימראז (PCR) חד-שלבית עבור כל דגימה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ולאחר מכן, קח את הצינורות ודגר אותם על קרח למשך 2 דקות לפני הניתוח עם ביו-אנלייזר.
2. RNA כולל מדולל rRNA
   1. הוסף 5 מיקרוגרם של RNA כולל, 50 מיקרוליטר של מאגר הכלאה ו-1-3 מיקרוליטר של תערובת בדיקה לצינור PCR טרי.
   2. בצע את השלבים הבאים: שלב ראשון, דנטורציה ב-70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות; שלב שני, הכלאה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות; ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
   3. בשפופרת טרייה, הוסף 500 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים ואת הדגימה; הניחו את התערובת על מעמד מגנטי למשך דקה אחת עד שהתמיסה תתבהר.
   4. השליכו בזהירות את הסופרנטנט. הסר את הצינור, שטוף את החרוזים על ידי הוספת 500 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז, והנח את התערובת בחזרה על המעמד המגנטי למשך דקה אחת. הסר את הסופרנטנט ברגע שהתמיסה מתבהרת.
   5. חזור על התהליך פי 5-7. מוסיפים 200 מיקרוליטר של מאגר הכלאה ומערבבים כראוי. שמור את הצינורות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
   6. מוסיפים לתערובת הנ"ל 100 מיקרוליטר של בדיקת RNA, מערבבים בעדינות ומדגרים את התערובת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
   7. סובב בקצרה את הצינור לפני הנחתו על המעמד המגנטי למשך דקה אחת.
   8. אספו את הסופרנטנט השקוף המכיל את הרנ"א המדולדל ב-rRNA בשפופרת טרייה.
3. פיצול RNA
   1. בשפופרת PCR טרייה, הוסף 8-10 מיקרוליטר של RNA כולל מדולדל rRNA (500 ננוגרם/גרם), 1 מיקרוליטר של מאגר פי 10 ו-1 מיקרוליטר של RNase III.
   2. מערבבים את התמיסה על ידי הקשה וסיבוב קצר.
   3. הנח את הצינורות במחזור תרמי למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
   4. בשפופרת טרייה, הוסף 5 מיקרוליטר של חרוזים קושרים חומצות גרעין ולאחר מכן, הוסף 90 מיקרוליטר של תרכיז תמיסת קשירה.
   5. הוסף לתערובת הנ"ל 30 מיקרוליטר משברי ה- RNA ו -150 מיקרוליטר של 100% אתנול. מערבבים את הדגימה על ידי פיפטינג פי 10, ודוגרים אותה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   6. הנח את הצינורות על המעמד המגנטי עד שהתמיסה תתבהר. הסר והשליך את הסופרנטנט.
   7. שטפו את החרוזים עם 150 מיקרוליטר אתנול בזמן שהצינורות נמצאים על מעמד מגנטי; הניחו לתערובת לעמוד במשך 30 שניות ואז הסירו את הסופרנטנט.
   8. השאירו את הצינורות על מעמד מגנטי למשך 1-2 דקות כדי לאפשר לאתנול שנותר להתאדות.
   9. הוסיפו לחרוזים 12 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז שחוממו מראש, וערבבו את הדגימה על ידי פיפטינג 10 פעמים.
   10. דגרו את הדגימה למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. הניחו את הצינורות על מעמד מגנטי ואספו את הסופרנטנט ברגע שהוא צלול.
4. הכנת ספרייה והכנת cDNA
   1. הוסף 3 מיקרוליטר מדגימת ה-RNA המפוצלת לצינור PCR ולאחר מכן הוסף 5 מיקרוליטר של תערובת הכלאה. מערבבים את הדגימה על ידי פיפטינג כמה פעמים ולאחר מכן סובבו את הדגימה בקצרה.
   2. שמור את הצינורות במחזור תרמי למשך 10 דקות ב-65 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן 5 דקות ב-30 מעלות צלזיוס.
   3. הוסף 10 מיקרוליטר של מאגר קשירה ו-2 מיקרוליטר של תערובת אנזימי קשירה לתמיסה לעיל. דגרו את התגובה במחזור תרמי למשך שעה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
   4. מוסיפים תערובת מאסטר טרנסקריפטאז הפוך לתערובת הקשירה ודוגרים בחום של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן דגירה על קרח.
5. הגברה של cDNA
   1. הוסף 6 מיקרוליטר של cDNA (500 ננוגרם) לצינור PCR טרי ולאחר מכן הוסף 46 מיקרוליטר של תערובת PCR מקודדת משפופרת המכילה 46 מיקרוליטר של אנזים פולימראז בנאמנות גבוהה ו-1 מיקרוליטר של פריימרים ברקוד 3'.
   2. הגדר את תנאי ה-PCR כדלקמן: שלב ראשון, החזק ב-94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; שלב שני, מחזורים ב-94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו-50 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות; שלב שלישי, 16 מחזורים ב-94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 62 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו-68 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. החזק את התגובה ב-68 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
   3. טהר את ה-cDNA המוגבר על ידי חזרה על שלבים 4.3.5 עד 4.3.10 והחלף את דגימת ה-RNA המפוצלת בתוצר ה-PCR שהתקבל בשלב הקודם.
   4. נתח את דגימת ה-RNA המטוהר ברצף (NGS) כדי ליצור נתונים בצורה של קבצי FASTq.

5. ביואינפורמטיקה

1. פתחו את כלי ה-galaxy הזמין באינטרנט על ידי העתקת הדבקת הקישור: https://usegalaxy.org ללשונית החיפוש של הדפדפן.
2. בביקור הראשון באתר זה, הירשם לפרופיל על ידי לחיצה על הכניסה או על אפשרות ההרשמה בפינה השמאלית העליונה.
3. לאחר יצירת חשבון, היכנס לחשבון על ידי מילוי השם הציבורי/שם המשתמש והסיסמה.
4. העלה את קבצי ה-FASTq שהתקבלו לאחר ניתוח RNA-seq על ידי לחיצה על אפשרות ההעלאה בחלונית הצד השמאלי.
5. בחר את הכלי cutadapt מקטע הכלים בחלונית השמאלית. כלי זה יחתוך רצפים באיכות נמוכה.
   הערה: כעת ניתן להשתמש בקובץ זה למיפוי.
6. לחץ על כפתור הכלי בחלונית הצד השמאלי וחפש את כלי כוכב ה-RNA. מלא את הפרטים באופן הבא: השתמש בקובץ הפלט של cutadapt, בחר את גנום הייחוס כגנום ייחוס אנושי (hg38) ושנה את אורך הרצף הגנומי סביב צמתים מבוארים ל-36. בחר את הפלט כספירת גנים ולחץ על אפשרות כלי ההפעלה בפינה השמאלית העליונה.
   הערה: כלי זה יפיק קובץ BAM.
7. בחר את הכלי ספירת תכונות מאפשרויות הכלי והעלה את קבצי ה-BAM שהתקבלו לאחר ניתוח כוכבי RNA. הגדר את איכות המיפוי המינימלית לכל אפשרות קריאה באפשרויות סינון הקריאה ל-10, ולחץ על אפשרות כלי ההפעלה בפינה השמאלית העליונה.
8. פתח את קובץ הפלט של featurecount מהחלונית הימנית והעתק את הנתונים לגיליון אלקטרוני. חשב את שינוי הקיפול ביחס לבקרה על ידי חלוקת מספר ספירות הקריאה שהתקבלו במבחן במספר ספירות הקריאה שהתקבלו בפקד בפקודה =log (שינוי קיפול, 2).
   הערה: שינוי קיפול <-2.0 נחשב כמצביע על הורדת רגולציה ושינוי קיפול > 2.0 נחשב להורדת רגולציה.

שינויים מורפולוגיים
הדגירה של תאי צינור הלבלב האנושיים בתווך חומצי שינתה את המורפולוגיה של התאים. דפוס תאים צפוף ודחוס הביא לתאים מפוזרים בתנאים חומציים, ומוות תאים הופך בולט עם הזמן. בהשוואה לתאים רגילים המכילים מדיום, תאי צינור התכווצו וקטנו בגודלם. שינוי ד...

שיטה זו פותחה כדי לקבוע את ההשפעות של תנאים חומציים על תאי אפיתל צינור הלבלב האנושיים שאינם סרטניים בחזרות ביולוגיות. שינוי ב-pH של המדיום גרם לתאים להיות במצב לחץ, ונצפה שינוי במורפולוגיה. התאים תורבבו ב-pH 6.0, 6.5 או 7.0 במשך 24 שעות וניטרו כל שעה כדי לייעל את תקופת הדגירה לניס?...

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

רנוקה גודשלוואר אסירת תודה ל-DBT על שסיפק לה את המלגה. רנוקה גודשלוואר מודה על העזרה שקיבלה מהמחלקה לביוכימיה, אוניברסיטת אוסמניה (היידראבאד) ולד"ר V. V. Ravikanth על הדרכתו בעת ניתוח נתוני ה-NGS. ד"ר מ. ססיקלה מכיר בסיוע הכספי שהתקבל מ-ICMR, משרד הבריאות, ממשלת הודו (מענק מס' 94/2020/5582/Proteomics-Adhoc/BMS).