Mezenkimal Kök Hücrelerden Elde Edilen Küçük Hücre Dışı Veziküllerin Klinik Araştırmalar İçin GMP Uyumlu Büyük Hacimli Örneklerden İzolasyonu

Mezenkimal kök hücrelerden (MSC-sEV'ler) türetilen küçük hücre dışı veziküller, minimal yan etkileri olan hücresiz bir tedavi yöntemi olarak vurgulanmıştır. Bu çalışma, hemodiyaliz ile ultrasantrifüjü birleştiren, tüm süreç için harcanan zamanı önemli ölçüde azaltan ve iyi üretim uygulamaları (GMP) standartlarına uyumu sağlayan bir protokol sunmaktadır.

Mezenkimal kök hücrelerden (MSC-sEV'ler) türetilen küçük hücre dışı veziküller (sEV), minimal yan etkileri olan hücresiz bir tedavi yöntemi olarak vurgulanmıştır. Buna karşılık, ultrasantrifüjleme ve boyut dışlama kromatografisi gibi geleneksel ekstraksiyon yöntemleri, zaman yoğunlukları, maliyetleri ve ölçeklenebilirlikleri ile sınırlıdır. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, hemodiyalizör ve ultrasantrifüjlemeyi entegre eden bir yöntem öneriyoruz. Bu yaklaşım, 100 kDa'lık moleküler ağırlık kesme (MWCO) membranına sahip bir hemodiyaliz cihazı kullanır, bu da bol miktarda proteini filtrelerken sEV'leri seçici olarak konsantre eder ve böylece sEV'lerin verimini ve saflığını artırır. Bu ilk saflaştırma adımını, sEV preparatını daha da rafine etmek için ultrasantrifüjleme takip eder. Bu iki teknolojinin entegrasyonu, yalnızca tüm süreç için harcanan zamanı önemli ölçüde azaltmakla kalmadı, aynı zamanda iyi üretim uygulamaları (GMP) standartlarına uyumu da sağladı. Buradaki yöntem, sEV'leri büyük hacimli numunelerden izole etmede yüksek verimlilik gösterir ve geleneksel yöntemlere göre önemli bir ilerleme sunar. Bu protokol, ölçeklenebilir, uygun maliyetli ve GMP uyumlu bir çözüm sağlayarak EV tabanlı tedavilerin klinik uygulamaya çevrilmesini hızlandırma sözü vermektedir.

Mezenkimal kök hücrelerden (MSC-sEV'ler) türetilen küçük hücre dışı veziküller, mRNA, mikro-RNA, sitokinler, lipitler ve metabolitler gibi çoklu bileşenlerle zenginleştirilmiş heterojen veziküllerdir¹. Son yıllarda, birçok çalışma, yaşlanma, doku dejenerasyonu, kanser ve inflamatuar bozukluk dahil olmak üzere bir dizi durumun ele alınmasında umut vaat eden, minimal yan etkilere^{sahip hücresiz} bir tedavi yöntemi olarak MSC-sEV'lerin muazzam terapötik potansiyelinin altını çizmiştir². Bununla birlikte, sEV'nin büyük ölçekli ekstraksiyonunda kritik bir zorluk devam etmektedir ve geleneksel yöntemlerin ya zahmetli bir şekilde zaman yoğun ya da ekonomik olarak mümkün olmadığı kanıtlanmıştır. Ayrıca, EV tabanlı tedavilerin klinik uygulaması ve çevirisi için tekrarlanabilirliğin sağlanması çok önemlidir⁷. Araştırmacılar, yalnızca basit ve verimli değil, aynı zamanda iyi üretim uygulamaları (GMP) standartlarına da uygun bir saflaştırma yöntemine şiddetle ihtiyaç duyuyorlar⁸.

Ultrasantrifüjleme, ultrafiltrasyon, boyut dışlama kromatografisi, immünoaffinite ve polimer çökeltme dahil olmak üzere geleneksel saflaştırma yöntemleri, önceki araştırmalarda kapsamlı bir şekilde uygulanmıştır⁹. Genel olarak, sEV izolasyonu için geleneksel yöntemler, düşük verim oranı, kaliteden ödün verilen saflık ve katı aseptik standartları karşılamadaki zorluklar gibi sınırlamalar sergiler. Ayrıca, önceki araştırmalar, olağanüstü performans elde etmek için mikroakışkan sistemler^10,11, etiketsiz manyetik izolasyon¹² ve kovalent kimya izolasyonu¹³ gibi umut verici tekniklerin potansiyelini bildirmiştir. Bununla birlikte, özel ekipman gereksinimi, bu ileri teknikleri araştırma ekiplerinin çoğunluğunun benimsemesini zorlaştırmaktadır. Özetle, GMP sınıfı sEV'leri büyük hacimli numunelerden izole etmenin etkili yöntemi, hem araştırma hem de klinik uygulamalarda çok sayıda ekibin ilerlemesini sınırlayan kritik bir engel olmaya devam etmektedir.

Ultrasantrifüjleme, sEV izolasyonu için en yaygın olarak benimsenen yöntemdir ve altın standart yöntem olarak kabul edilmektedir^14,15. sEV'leri izole etmek için yoğunluk ve boyuttaki farklılıklardan yararlanan bir tekniktir. İzole edilmiş sEV'ler, artık kirleticileri ortadan kaldırmak için genellikle fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulanır. Daha sonra, durulanan sEV'leri yeniden süspanse etmek için genellikle uygun bir PBS hacmi kullanılır ve PBS hacmi kontrol edilerek beklenen farklı sEV konsantrasyonları hasat edilebilir. Ayrıca, ultrasantrifüjleme ile elde edilen plazma sEV'lerin saflığının, boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile izole edilen plazma sEV'lerinden daha iyi göründüğü ve ultrasantrifüjleme ile elde edilen sEV'lerin daha düşük veziküler hücre dışı partiküller (NVEP'ler) safsızlıklarına sahip olduğu bildirilmektedir. Bu aynı zamanda ultrasantrifüjlemeyi en yaygın kullanılan ve yüksek konsantrasyonlarda sEV gerektiren birçok tedavide değiştirilmesi zor hale getirir. Bununla birlikte, kalite ve saflığa ek olarak, büyük hacimli sEV ekstraksiyonunda verimlilik de göz ardı edilemeyecek bir faktördür. Şimdiye kadar, tek bir ultrasantrifüj turu, yaklaşık 600 mL'ye kadar bir numune hacmini destekleyebilir, bu da sadece ultrasantrifüjleme¹⁶ ile büyük ölçekli ekstraksiyon talebini karşılamanın zor olduğunu belirler.

Bir hemodiyaliz cihazı, binlerce içi boş lifi barındıran zar bazlı bir modülden oluşur. Kan, kapalı bir silindirik oda¹⁷ içinde bu liflerden dolaşır. Kanın bileşenleri, moleküler büyüklüklerine ve iyonik konsantrasyonlarına bağlı olarak bu zarlardan seçici olarak geçebilir. Klinikte, hastaların^kanındaki atık ürünleri ve fazla sıvıları uzaklaştırmak için yapay böbrek olarak yaygın olarak kullanılmaktadır ^18,19,20. Başka bir deyişle, hemodiyalizör, teğetsel akış filtrasyonuna (TFF) benzer bir prosese dayanarak büyük hacimli numuneleri konsantre etme potansiyeline de sahiptir. Uluslararası Hücre Dışı Veziküller Derneği (ISEV) tarafından yayınlanan son kılavuzda, sEV konsantrelerinin hücre kültürü ortamı gibi büyük hacimli numuneler için uygun olduğu düşünülmektedir. Onlarca yıllık geliştirmeden sonra, hemodiyalizörler, bol miktarda olgun sarf malzemesi ve yetenekli operatörlerden oluşan bir havuzla desteklenerek hastanelerde yaygın olarak benimsenmiştir ve bu da numuneyi steril tutmayı kolaylaştırır.

Bu çalışma, GMP'lerle uyumlu bir hemodiyalizör ve ultrasantrifüje dayalı bir sEV saflaştırma yöntemi sunmaktadır. Burada, sEV'leri etkili bir şekilde yakaladığı ve çok sayıda proteini filtrelediği gösterilen 100 kDa moleküler ağırlık kesme (MWCO) diyalizörlerini seçiyoruz²². Ultrasantrifüjleme ayrıca daha fazla saflaştırma için bir adım sağlar. Çalışma, hemodiyalizörün sEV'lerin konsantrasyonu için eşit derecede uygun olduğunu göstermektedir. Bu protokol, araştırmacıların sEV'leri büyük hacimli örneklerden verimli bir şekilde izole etmelerini sağlar. Halen devam etmekte olan ve henüz tamamlanmamış olan klinik araştırmayı Çin Klinik Araştırma Kayıt Defteri'ne (ChiCTR, NO. ChiCTR2200059018) kaydettik. Klinik veriler şu anda yayınlanmak üzere hazır olmasa da, bu protokolde bildirildiği gibi sEV'lerin üretilmesi için güvenilir, büyük ölçekli, verimli ve uyumlu bir yöntem, klinik öncesi ve klinik çalışmaların yürütülmesi için bir ön koşuldur.

Protokol, Southwest Hastanesi İnsan Araştırmaları Etik Kurulu'na uygun olarak onaylandı ve yürütüldü.

1. Hücre kalıntılarının kültür ortamından çıkarılması

NOT: Aşağıdaki prosedürler, özellikle numunelerin doğrudan çevreye maruz kalabileceği durumlarda, GMP uyumlu bir ortamda çalıştırılmalıdır.

1. Mikrobiyota içerme gereksinimi göz önüne alındığında, etkili sterilizasyon için filtrenin ve kauçuk tüpün otoklavlandığından emin olun. Kültür ortamıyla karşılaşabilecek diğer tüm sarf malzemelerinin steril ve kapalı ambalajlarda olduğundan emin olun. Laminer akış kabininde hücre kalıntılarını temizleme işlemini gerçekleştirin.
2. 0.45 μm ve 0.22 μm filtrasyon membranını filtre aparatına monte edin. Peristaltik bir pompayı (Malzeme Tablosuna bakın) ve filtre aparatını kauçuk tüp ile bağlayın. 0,45 μm'lik zarı 0,22 μm'lik zarın üzerine yerleştirin; aksi takdirde filtrasyon verimliliğini düşürebilir (Şekil 1). Mikrofiltrasyon membranının ön ve arka taraflarını ayırt etmeye dikkat edin.
3. Filtrasyon için peristaltik pompayı çalıştırın. Pompa ile çalıştırılan, %5 takviyeli mezenkimal kök hücre bazal ortamı (MSCBM) (Malzeme Tablosuna bakınız) filtrenin bir ucundan geçer ve filtrelenmiş kültür ortamı, gösterildiği gibi filtrenin diğer ucunda elde edilebilir (Şekil 1). Filtrelenmiş kültür ortamını çift kanallı bir drenaj torbasında toplayın. Peristaltik pompa hızını optimize ederek ve gerektiğinde filtrasyon membranını değiştirerek filtrasyon sisteminin bütünlüğünü koruyun.
4. Filtrasyon tamamlandıktan sonra, drenaj torbası üzerindeki giriş vanasını kapatın ve parafilm ile daha fazla kapatın (Malzeme Tablosuna bakın). Bir sonraki adıma geçin veya filtrelenmiş hücre kültürü ortamını geçici olarak 4 °C'de saklayın.

2. Filtrelenmiş kültür ortamının bir hemodiyalizör ile konsantre edilmesi

NOT: Hemodiyalizördeki kan sızıntısı detektörü etkinleştirileceği veya hemodiyalizör ayarında kan sızıntısı detektörünü kapatacağı için, hücre kültüründe fenol kırmızısı içeren Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unu (DMEM) kullanmaktan kaçının.

1. Sarf malzemelerini hazırlayın.
   1. Konsantrasyondan önce kan hatları, 100 kDa MWCO yüksek akı polisülfon membranları, kan diyalizörü, infüzyon seti, fizyolojik tuzlu su çözeltisi, infüzyon torbası, iyot çözeltisi ve pamuklu çubuklar hazırlayın (bkz.
2. Sistemi açın ve kendi kendine test edin.
   1. Hemodiyalizör güç kablosunun bağlantısını kontrol edin ve ana gücü açın.
   2. Makinenin tüm kendi kendine teşhis prosedürünü tamamlamasını bekleyin.
3. Kan hatlarını ve diyalizörü takın.
   1. Tek kullanımlık kan hatlarının ve kan diyalizörünün son kullanma tarihlerini doğrulayın, dış ambalajlarının bütünlüğünü sağlayın ve hatlarda herhangi bir hasar olup olmadığını kontrol edin.
   2. Boruyu, ekstrakorporeal devredeki kan akışıyla aynı yönde takın ve kapalı döngü sirkülasyonu oluşturmak için branşman valflerini sırayla kapatın.
4. Durulama prosedürünü başlatın.
   1. Fizyolojik tuzlu su çözeltisini (heparin içermeyen) pompadan önce bir tüpten diyaliz devresine bağlamak için bir infüzyon seti kullanın. Venöz toplama bölgesini atık sıvı torbasına bağlayın.
      NOT: Fizyolojik salin, heparin veya başka herhangi bir antikoagülan içermemelidir.
   2. Diyalizat besleme/dönüş hatlarını diyalizöre bağlayın.
   3. Hemodiyalizörü başlatın ve akış hızını 80-100 mL/dk'ya ayarlayın. Tüm boru sisteminin sıvıyla dolduğundan emin olmak için diyaliz devresindeki ve diyalizördeki tüm havayı dışarı atın.
   4. Arteriyel ve venöz odacıklardaki sıvı düzlemini yaklaşık 2/3 oranında ayarlayın. Salin sırayla arteriyel hat, diyalizör, venöz hat ve atık sıvı torbası boyunca akar.
5. Ultrafiltrasyon konsantrasyonunu başlatın.
   1. Durulama prosedürünü bitirdikten sonra, filtrelenmiş kültür ortamını içeren drenaj torbasını infüzyon standına asın, çıkış kanalını iyotla ıslatılmış pamuklu çubuklarla dezenfekte edin ve drenaj torbasının çıkış kanalını bir infüzyon seti kullanarak bir ön pompa portuna bağlayın.
   2. Arteriyel porta ve kan hatlarının venöz portuna katılın. İzole bir ultrafiltrasyon (ISO-UF, diyalizat akışı olmayan ultrafiltrasyon) diyaliz devresi kurun (Şekil 1).
   3. Diyaliz makinesindeki ultrafiltrasyon hedef hacmini, drenaj torbasında bulunan toplam sıvı hacmine karşılık gelecek şekilde ayarlayın. Ultrafiltrasyonun diyaliz süresini sistemin minimum çalışma süresine ayarlayın. Parametreler başarıyla ayarlandıktan sonra ultrafiltrasyonu başlatın.
      NOT: Hemodiyaliz sisteminin hesaplanması nedeniyle diyaliz süresi çok kısa olmayacak, ancak daha ılımlı bir oranda sürdürülecektir.
6. Konsantre sıvıyı elde edin.
   1. Hedef dehidrasyon hacmine ulaştıktan sonra, arteriyel klempi kapatın ve venöz portu steril bir infüzyon torbasına bağlayın.
   2. Bir hava filtresi ile donatılmış tek kullanımlık kan hatlarının ön pompa portunu açın. Kan pompasını yaklaşık 50 mL / dk hızında aktive edin ve kan hatları içindeki sıvının arteriyel hattan venöz hatta bir kez daha dolaşmasına izin verin. Yaklaşık 158 mL olan tüm konsantre sıvıyı devreden steril infüzyon torbasına geri çekin.
   3. Konsantrasyonun geç aşamasında, boşa harcanan sıvıyı diyalizat dönüş hattından toplayın. Konsantrasyon sırasında meydana gelmiş olabilecek herhangi bir kazara sEV kaybını izlemek için boşa harcanan sıvı numunesine konsantre kültür ortamınınkiyle aynı müteakip işlemleri uygulayın.
   4. Tüm valfleri kapatın ve infüzyon torbasını, diyalizörü ve tüm hatları çıkarın. Güç kaynağını kapatın ve makineyi silerek dezenfekte edin.

3. sEV'lerin ultrasantrifüj ile ayrılması

1. Konsantre kültür ortamını ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve ardından dengeleyin.
2. Klinik dereceli bir ultrasantrifüjde (Malzeme Tablosuna bakınız) 110.000 × g'da 70 dakika boyunca santrifüjleyin, ardından peleti steril tuzlu su çözeltisiyle yıkayın ve 70 dakika daha 110.000 × g'da ikinci bir santrifüjleme ile devam edin.
3. Peletlenmiş sEV'leri uygun miktarda steril tuzlu su çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.
4. Daha fazla test için sEV'leri steril bir tüpe aktarın veya ileride kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.

4. Elde edilen sEV'lerin karakterizasyonu

1. Nanopartikül izleme analizi (NTA)
   1. Elde edilen sEV'leri (1 μL) PBS (1 mL) ile seyreltin (Malzeme Tablosuna bakınız). Geçerli görüş alanında görünen sEV sayısını 50 ile 200 arasında olacak şekilde ayarlayın.
   2. Seyreltilmiş numuneyi, hava kabarcıklarının girmesini önleyerek numune kuyucuğuna dikkatlice enjekte edin.
   3. Ölçümü, görüş alanındaki parçacık sayısı tüm konumlar için mümkün olduğunca yüksek ve kararlı olduğunda gerçekleştirin. Analiz parametreleri aşağıdaki gibidir: Maksimum Alan: 1000, Min Alan: 10, Min Parlaklık: 30, İz uzunluğu: 15, Sıcaklık: 25 °C, Hassasiyet: 75.
   4. Her numuneyi en az üç kez ölçün.
2. Batı lekeleme analizi
   1. PBS'de sEV çözeltisini seyreltin. Protein konsantrasyonunu ölçmek için bir Bikinkoninik Asit (BCA) Protein Test Kiti (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın.
   2. sEV'leri numune tamponunda 100 °C'de 5 dakika kaynatın.
   3. % 12 sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) jeli hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız). Jel elektroforez aparatını monte edin. SDS-PAGE jel kuyucuklarına her numuneden eşit miktarda protein yükleyin. Elektroforez voltajını konsantrasyon için 80 V'a ve ayırma için 100 V'a ayarlayın.
   4. Poliviniliden diflorür (PVDF) membranını (Malzeme Tablosuna bakınız) metanol ile 1 dakika aktive edin, ardından 1 saat boyunca 100 V'ta transfere devam etmeden önce PVDF membranını transfer tamponuna batırın.
   5. PVDF membranını% 5 sığır serum albümini (BSA; Malzeme Tablosuna bakınız) içeren TBST tamponuna (20 mM Tris, 150 mM NaCl ve% 0.1 Tween 20) daldırın ve ardından 30 dakika boyunca bloke edin.
   6. PVDF membranını birincil antikor ile gece boyunca bir çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de inkübe edin. Kullanılan birincil antikorlar aşağıdaki gibidir: insan anti-CD63 (1:1000 seyreltme), insan anti-CD9 (1:1000 seyreltme) ve insan anti-HSP70 (1:1000 seyreltme) (bkz.
   7. Ertesi gün, PVDF membranını TBST çözeltisi ile her biri 5 dakika boyunca beş kez yıkayın ve daha sonra HRP ile konjuge ikincil antikor (1:10000 seyreltme) ile oda sıcaklığında (RT) 1 saat inkübe edin.
   8. TBST ile beş kez yıkadıktan sonra, bir kemilüminesans sisteminde görüntüleme için bir kemilüminesans tespit reaktifi kullanın.
3. Transmisyon elektron mikroskobu
   1. Bir mumlu kağıda 20 μL PBS ile seyreltilmiş numune damlası ekleyin. Ardından, numune damlasının bakır ızgarayı kaplayabilmesi için damlanın üzerine bir bakır ızgara yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 20 dakika RT'de bekletin.
   2. Fazla sıvıyı filtre kağıdı ile emdirin. Daha sonra numuneleri 20 μL'lik %2 paraformaldehit, %2 glutaraldehit ve 0.05 M fosfat çözeltisi çözeltisinde 2 dakika sabitleyin.
   3. Bakır ızgarayı çift damıtılmış suyla üç kez durulayın, ardından RT'de 1 dakika boyunca 20 μL %2 fosfotungstik asit (PTA) ile boyayın.
   4. Fazla sıvıyı filtre kağıdı ile emdirin. Transmisyon elektron mikroskobu ile analiz edilmeden önce ızgaraları gece boyunca kurutun (Malzeme Tablosuna bakınız).
      NOT: TEM için önerilen ayarlar aşağıdaki gibidir: Pozlama: 1.0 s, HT Voltajı 100.00 kV, Işın Akımı: 50 μA, Spot Boyutu: 1, Mod: TEM. Bu ayarlar, üreticinin talimatlarına göre değişebilir (bkz. Malzeme Tablosu).

sEV'lerin morfolojik karakterizasyonu
Konsantrasyonun son aşamasında, boşa harcanan sıvı da tarif edildiği gibi toplandı. Konsantre ortam ve boşa harcanan sıvı sırasıyla ultrasantrifüj edildi. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) analizi için yağışları topladık. Beklendiği gibi, konsantre ortam grubunda önemli sayıda fincan şeklinde nanovezikül gözlenmiştir (Şekil 2A,B)....

sEV'lerin izolasyonu için geleneksel yöntemler arasında, her biri kendi avantajları ve dezavantajları olan diferansiyel ultrasantrifüjleme, boyut dışlama kromatografisi ve PEG çökeltme yer alır. Bu farklı tekniklerin birleştirilmesi sEV'lerin verimini veya saflığını artırabilirken, ek adımlar genellikle numune kontaminasyonu için daha fazla fırsat sunar. Piyasada sEV'leri toplu olarak çıkardığını ve GMP standartlarına uyduğunu iddia eden entegre sistemler bul...

Yazarlar rekabet eden hiçbir mali çıkar beyan etmemektedir.

Bu çalışma, Çin Ulusal Bilim Vakfı (822101167, BB'ye) ve Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı (CSTB2022NSCQ-MSX0020'dan BB'ye), Chongqing Doktora "Trenle" Çin Bilimsel Araştırma Projesi (CSTB2022BSXM-JCX0031'dan BB'ye) ve Çin Ulusal Bilim Vakfı'ndan (82271132'den YL'ye) sağlanan fonlarla desteklenmiştir. Nefroloji Anabilim Dalı, Birinci bağlı hastane, Üçüncü Askeri Tıp Üniversitesi (Ordu Tıp Üniversitesi) ve Patoloji Enstitüsü ve Güneybatı Kanser Merkezi, Güneybatı Hastanesi, Üçüncü Askeri Tıp Üniversitesi (Ordu Tıp Üniversitesi) ekipman ve teknik destek için.