Isolierung von kleinen extrazellulären Vesikeln aus mesenchymalen Stammzellen aus großvolumigen Proben mit GMP-Konformität für klinische Studien

Kleine extrazelluläre Vesikel, die aus mesenchymalen Stammzellen (MSC-sEVs) gewonnen werden, wurden als zellfreie Behandlungsmethode mit minimalen Nebenwirkungen hervorgehoben. Diese Studie liefert ein Protokoll, das Hämodialyse mit Ultrazentrifugation kombiniert, wodurch der Zeitaufwand für den gesamten Prozess erheblich reduziert und die Einhaltung der GMP-Standards (Good Manufacturing Practice) sichergestellt wird.

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEV), die aus mesenchymalen Stammzellen (MSC-sEVs) gewonnen werden, wurden als zellfreie Behandlungsmethode mit minimalen Nebenwirkungen hervorgehoben. Im Gegensatz dazu sind traditionelle Extraktionsmethoden wie Ultrazentrifugation und Größenausschlusschromatographie durch ihre Zeitintensität, Kosten und Skalierbarkeit begrenzt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, schlagen wir eine Methode vor, die einen Hämodialysator und eine Ultrazentrifugation integriert. Bei diesem Ansatz wird ein Hämodialysegerät mit einer 100 kDa Molekulargewichts-Cut-off-Membran (MWCO) verwendet, die sEVs selektiv konzentriert und gleichzeitig eine Vielzahl von Proteinen herausfiltert, wodurch die Ausbeute und Reinheit von sEVs verbessert wird. Auf diesen ersten Reinigungsschritt folgt die Ultrazentrifugation, um die sEV-Präparation weiter zu verfeinern. Die Integration dieser beiden Technologien reduzierte nicht nur den Zeitaufwand für den gesamten Prozess erheblich, sondern stellte auch die Einhaltung der Standards der guten Herstellungspraxis (GMP) sicher. Die Methode zeigt eine hohe Effizienz bei der Isolierung von sEVs aus einem großen Probenvolumen, was einen deutlichen Fortschritt gegenüber herkömmlichen Methoden darstellt. Dieses Protokoll ist vielversprechend, um die Umsetzung von EV-basierten Therapien in die klinische Praxis zu beschleunigen, indem es eine skalierbare, kostengünstige und GMP-konforme Lösung bietet.

Kleine extrazelluläre Vesikel, die aus mesenchymalen Stammzellen (MSC-sEVs) gewonnen werden, sind heterogene Vesikel, die mit mehreren Komponenten wie mRNA, micro-RNA, Zytokinen, Lipiden und Metaboliten angereichert^{sind 1}. In den letzten Jahren haben viele Studien das immense therapeutische Potenzial von MSC-sEVs als zellfreie Behandlungsmethode mit minimalen Nebenwirkungen unterstrichen² und sich als vielversprechend bei der Behandlung eines Spektrums von Erkrankungen erwiesen, darunter Alterung, Gewebedegeneration, Krebs und Entzündungsstörungen 3,4,5,6 . Dennoch bleibt eine kritische Herausforderung bei der großtechnischen Extraktion von sEV bestehen, da sich traditionelle Methoden entweder als mühsam zeitintensiv oder wirtschaftlich nicht durchführbar erweisen. Darüber hinaus ist die Sicherstellung der Reproduzierbarkeit für die klinische Anwendung und Translation von EV-basierten Therapien von größter Bedeutung⁷. Die Forscher benötigen dringend eine Reinigungsmethode, die nicht nur einfach und effizient ist, sondern auch den Standards der guten Herstellungspraxis (GMP) entspricht⁸.

Die konventionellen Reinigungsmethoden, einschließlich Ultrazentrifugation, Ultrafiltration, Größenausschlusschromatographie, Immunaffinität und Polymerfällung, wurden in früheren Forschungen ausgiebig angewendet⁹. Im Allgemeinen weisen herkömmliche Methoden zur Isolierung von sEV Einschränkungen auf, wie z. B. eine niedrige Ausbeute, eine beeinträchtigte Reinheit und Herausforderungen bei der Einhaltung strenger aseptischer Standards. Darüber hinaus wurde in früheren Forschungen über das Potenzial vielversprechender Techniken wie mikrofluidische Systeme^10,11, markierungsfreie magnetische Isolierung¹² und kovalente chemische Isolierung¹³ berichtet, um eine herausragende Leistung zu erzielen. Der Bedarf an Spezialausrüstung macht es jedoch für die Mehrheit der Forschungsteams schwierig, diese fortschrittlichen Techniken zu übernehmen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die effiziente Methode zur Isolierung von sEVs in GMP-Qualität aus einer großen Menge von Proben nach wie vor ein kritisches Hindernis darstellt, das den Fortschritt zahlreicher Teams sowohl in der Forschung als auch in der klinischen Anwendung einschränkt.

Die Ultrazentrifugation ist die am weitesten verbreitete Methode zur Isolierung von sEV und gilt als Goldstandardmethode^14,15. Es handelt sich um eine Technik, die Unterschiede in Dichte und Größe nutzt, um sEVs zu isolieren. Isolierte sEVs werden üblicherweise mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült, um Restverunreinigungen zu entfernen. Dann wird im Allgemeinen ein angemessenes Volumen PBS verwendet, um die gespülten sEVs zu resuspendieren, und unterschiedliche erwartete Konzentrationen von sEVs können durch Kontrolle des PBS-Volumens entnommen werden. Darüber hinaus wird berichtet, dass die Reinheit von Plasma-sEVs, die durch Ultrazentrifugation erhalten werden, besser zu sein scheint als die von Plasma-sEVs, die durch Größenausschlusschromatographie (SEC) isoliert wurden, und dass die durch Ultrazentrifugation erhaltenen sEVs einen geringeren Gehalt an nicht-vesikulären extrazellulären Partikeln (NVEPs) aufweisen. Dies macht die Ultrazentrifugation auch zur am weitesten verbreiteten und schwer zu ersetzenden Behandlung bei vielen Behandlungen, die hohe Konzentrationen von sEVs erfordern. Neben Qualität und Reinheit ist aber auch die Effizienz ein Faktor, der bei der großvolumigen sEV-Extraktion nicht außer Acht gelassen werden darf. Bisher kann eine einzige Runde der Ultrazentrifugation ein Probenvolumen von bis zu etwa 600 ml unterstützen, was zeigt, dass es schwierig ist, die Nachfrage nach einer Extraktion in großem Maßstab nur durch Ultrazentrifugation zu decken¹⁶.

Ein Hämodialysegerät besteht aus einem membranbasierten Modul, das Tausende von Hohlfasern beherbergt. Durch diese Fasern zirkuliert Blut in einer geschlossenen zylindrischen Kammer¹⁷. Die Bestandteile des Blutes können diese Membranen aufgrund ihrer Molekülgröße und Ionenkonzentration selektiv passieren. In der Klinik wird es häufig als künstliche Niere verwendet, um Abfallprodukte und überschüssige Flüssigkeiten aus dem Blut von Patienten zu entfernen 18,19,20. Mit anderen Worten, der Hämodialysator hat auch das Potenzial, großvolumige Proben zu konzentrieren, wobei er sich auf ein Verfahren stützt, das der Tangentialflussfiltration (TFF) ähnelt. In der aktuellen Leitlinie der International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) gelten sEV-Konzentrate als geeignet für großvolumige Proben, wie z. B. Zellkulturmedium. Nach jahrzehntelanger Entwicklung haben sich Hämodialysatoren in Krankenhäusern weit verbreitet, unterstützt durch eine Fülle ausgereifter Verbrauchsmaterialien und einen Pool qualifizierter Bediener, die es einfacher machen, die Probe steril zu halten.

In dieser Studie wird eine sEV-Aufreinigungsmethode vorgestellt, die auf einem Hämodialysator und einer Ultrazentrifuge basiert, die mit GMPs kompatibel sind. Hier wählen wir Dialysatoren mit einem Molekulargewichts-Cut-off (MWCO) von 100 kDa, von denen gezeigt wurde, dass sie sEVs effektiv einfangen und zahlreiche Proteine herausfiltern^{können 22}. Die Ultrazentrifugation bietet auch einen Schritt für die weitere Reinigung. Die Arbeit zeigt, dass der Hämodialysator gleichermaßen für die Konzentration von sEVs geeignet ist. Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, sEVs aus großvolumigen Proben effizient zu isolieren. Wir haben die klinische Studie im chinesischen Register für klinische Studien (ChiCTR, Nr. ChiCTR2200059018) registriert, die noch im Gange ist und noch nicht abgeschlossen wurde. Obwohl klinische Daten derzeit nicht ohne weiteres für eine Veröffentlichung verfügbar sind, ist eine zuverlässige, groß angelegte, effiziente und konforme Methode zur Herstellung von sEVs, wie sie in diesem Protokoll beschrieben wird, eine Voraussetzung für die Durchführung präklinischer und klinischer Studien.

Das Protokoll wurde in Übereinstimmung mit der Ethikkommission für die Humanforschung des Southwest Hospital genehmigt und durchgeführt.

1. Entfernen von Zelltrümmern aus dem Kulturmedium

HINWEIS: Die folgenden Verfahren sollten in einer GMP-konformen Umgebung durchgeführt werden, insbesondere wenn die Proben direkt der Umgebung ausgesetzt sein können.

1. Stellen Sie angesichts der Anforderung einer Mikrobiota-Freiheit sicher, dass der Filter und der Gummischlauch für eine effektive Sterilisation autoklaviert sind. Stellen Sie sicher, dass alle anderen Verbrauchsmaterialien, die mit dem Nährmedium in Berührung kommen könnten, steril und in einer versiegelten Verpackung sind. Führen Sie den Prozess der Entfernung von Zelltrümmern in einem Laminar-Flow-Schrank durch.
2. Montieren Sie die 0,45 μm und 0,22 μm Filtrationsmembran an der Filtervorrichtung. Verbinden Sie eine Schlauchpumpe (siehe Materialtabelle) und die Filtervorrichtung mit dem Gummischlauch. Positionieren Sie die 0,45-μm-Membran über der 0,22-μm-Membran; Andernfalls kann die Filtrationseffizienz verringert werden (Abbildung 1). Achten Sie auf die Unterscheidung zwischen Vorder- und Rückseite der Mikrofiltrationsmembran.
3. Starten Sie die Schlauchpumpe für die Filtration. Angetrieben von der Pumpe durchläuft das mesenchymale Stammzell-Basalmedium (MSCBM) mit 5 % Zugabe (siehe Materialtabelle) den Filter, und das gefilterte Kulturmedium kann am anderen Ende des Filters gewonnen werden, wie in Abbildung 1 gezeigt. Sammeln Sie das gefilterte Kulturmedium in einem Drainagebeutel mit zwei Kanälen. Bewahren Sie die Integrität des Filtrationssystems, indem Sie die Drehzahl der Schlauchpumpe optimieren und die Filtrationsmembran nach Bedarf austauschen.
4. Nachdem die Filtration abgeschlossen ist, schließen Sie das Einlassventil am Entleerungsbeutel und versiegeln Sie es weiter mit Parafilm (siehe Materialtabelle). Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort oder lagern Sie das gefilterte Zellkulturmedium vorübergehend bei 4 °C.

2. Konzentrieren des gefilterten Kulturmediums mit einem Hämodialysator

HINWEIS: Verzichten Sie auf die Verwendung von Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), das Phenolrot in Zellkulturen enthält, da der Blutleckdetektor im Hämodialysator aktiviert wird oder den Blutleckdetektor in der Hämodialysatoreinstellung abschaltet.

1. Bereiten Sie die Verbrauchsmaterialien vor.
   1. Bereiten Sie Blutschläuche, 100 kDa MWCO-Polysulfonmembranen mit hohem Fluss, Blutdialysator, Infusionsset, physiologische Kochsalzlösung, Infusionsbeutel, Jodlösung und Wattestäbchen vor der Konzentration vor (siehe Materialtabelle).
2. Schalten Sie das System ein und testen Sie es selbst.
   1. Überprüfen Sie den Anschluss des Stromkabels des Hämodialysators und schalten Sie die Hauptstromversorgung ein.
   2. Warten Sie, bis das Gerät den gesamten Selbstdiagnosevorgang abgeschlossen hat.
3. Installieren Sie die Blutschläuche und den Dialysator.
   1. Überprüfen Sie das Verfallsdatum der Einweg-Blutschläuche und des Blutdialysators, stellen Sie die Unversehrtheit der Außenverpackung sicher und prüfen Sie, ob die Leitungen beschädigt sind.
   2. Installieren Sie den Schlauch in der gleichen Richtung, in der der Blutfluss im extrakorporalen Kreislauf fließt, und schließen Sie nacheinander die Abzweigventile, um einen geschlossenen Kreislauf zu bilden.
4. Starten Sie den Spülvorgang.
   1. Verwenden Sie ein Infusionsset, um die physiologische Kochsalzlösung (ohne Heparin) aus einem Schlauch vor der Pumpe an den Dialysekreislauf anzuschließen. Verbinden Sie die venöse Entnahmestelle mit dem Abfallflüssigkeitsbeutel.
      HINWEIS: Die physiologische Kochsalzlösung sollte kein Heparin oder andere Antikoagulanzien enthalten.
   2. Verbinden Sie die Dialysat-Vor-/Rücklaufleitungen mit dem Dialysator.
   3. Starten Sie den Hämodialysator und stellen Sie die Flussrate auf 80-100 mL/min ein. Stoßen Sie die gesamte Luft aus dem Dialysekreislauf und dem Dialysator aus, um sicherzustellen, dass das gesamte Schlauchsystem mit Flüssigkeit gefüllt ist.
   4. Stellen Sie die Flüssigkeitsebene in den arteriellen und venösen Kammern auf etwa 2/3 voll ein. Die Kochsalzlösung fließt nacheinander durch den arteriellen Zugang, den Dialysator, den Venenzugang und den Abfallflüssigkeitsbeutel.
5. Starten Sie die Ultrafiltrationskonzentration.
   1. Hängen Sie nach Beendigung des Spülvorgangs den Drainagebeutel mit dem gefilterten Nährmedium auf den Infusionsständer, desinfizieren Sie den Auslasskanal mit jodgetränkten Wattestäbchen und verbinden Sie den Auslasskanal des Drainagebeutels mit einem Infusionsset mit einem Vorpumpenanschluss.
   2. Verbinden Sie den arteriellen Port und den venösen Port der Blutlinien. Einrichtung eines isolierten Ultrafiltrationsdialysekreislaufs (ISO-UF, Ultrafiltration ohne Dialysatfluss) (Abbildung 1).
   3. Stellen Sie das Ultrafiltrationszielvolumen am Dialysegerät so ein, dass es dem Gesamtvolumen der im Drainagebeutel vorhandenen Flüssigkeit entspricht. Stellen Sie die Dialysezeit der Ultrafiltration auf die minimale Betriebszeit des Systems ein. Nachdem die Parameter erfolgreich eingestellt wurden, starten Sie die Ultrafiltration.
      HINWEIS: Aufgrund der Berechnung des Hämodialysesystems wird die Dialysezeit nicht zu kurz sein, sondern in einem moderateren Tempo gehalten.
6. Holen Sie sich die konzentrierte Flüssigkeit.
   1. Nachdem Sie das angestrebte Dehydrationsvolumen erreicht haben, schließen Sie die arterielle Klemme und verbinden Sie den venösen Port mit einem sterilen Infusionsbeutel.
   2. Öffnen Sie den Vorpumpenanschluss der Einweg-Blutschläuche, die mit einem Luftfilter ausgestattet sind. Aktivieren Sie die Blutpumpe mit einer Geschwindigkeit von ca. 50 ml/min, so dass die Flüssigkeit in den Blutbahnen wieder von der arteriellen Leitung zur venösen Leitung zirkulieren kann. Ziehen Sie die gesamte konzentrierte Flüssigkeit, ca. 158 ml, aus dem Kreislauf zurück in den sterilen Infusionsbeutel.
   3. In der späten Phase der Konzentration sammeln Sie die verschwendete Flüssigkeit aus der Dialysat-Rücklaufleitung. Wenden Sie nachfolgende Prozesse, die mit denen des konzentrierten Nährmediums identisch sind, auf die verschwendete Flüssigkeitsprobe an, um einen versehentlichen Verlust von sEVs zu überwachen, der während der Konzentration aufgetreten sein könnte.
   4. Schließen Sie alle Ventile und entfernen Sie den Infusionsbeutel, den Dialysator und alle Leitungen. Schalten Sie die Stromversorgung aus und desinfizieren Sie die Maschine, indem Sie sie abwischen.

3. Trennung der sEVs mit Ultrazentrifuge

1. Übertragen Sie das konzentrierte Kulturmedium in Ultrazentrifugenröhrchen und balancieren Sie diese dann aus.
2. Zentrifugieren Sie in einer Ultrazentrifuge in klinischer Qualität (siehe Materialtabelle) bei 110.000 × g für 70 min, waschen Sie dann das Pellet mit steriler Kochsalzlösung und fahren Sie mit einer zweiten Zentrifugation bei 110.000 × g für weitere 70 min fort.
3. Resuspendieren Sie die pelletierten sEVs in einer angemessenen Menge steriler Kochsalzlösung.
4. Füllen Sie die sEVs für weitere Tests in ein steriles Röhrchen um oder lagern Sie sie für die zukünftige Verwendung bei -80 °C.

4. Charakterisierung der erhaltenen sEV

1. Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)
   1. Verdünnen Sie die erhaltenen sEVs (1 μL) mit PBS (1 mL) (siehe Materialtabelle). Stellen Sie die Anzahl der im aktuellen Sichtfeld sichtbaren sEVs auf 50 bis 200 ein.
   2. Injizieren Sie die verdünnte Probe vorsichtig in die Probenvertiefung, um das Eindringen von Luftblasen zu vermeiden.
   3. Führen Sie die Messung durch, wenn die Anzahl der Partikel im Sichtfeld für alle Positionen so hoch und stabil wie möglich ist. Die Analyseparameter lauten wie folgt: Max. Bereich: 1000, Min. Bereich: 10, Min. Helligkeit: 30, Spurlänge: 15, Temperatur: 25 °C, Empfindlichkeit: 75.
   4. Messen Sie jede Probe mindestens dreimal.
2. Western-Blotting-Analyse
   1. Verdünnen Sie die sEVs-Lösung in PBS. Verwenden Sie ein Bicinchoninsäure (BCA)-Protein-Assay-Kit (siehe Materialtabelle), um die Proteinkonzentration zu messen.
   2. Die sEVs werden im Probenpuffer bei 100 °C 5 min lang gekocht.
   3. Bereiten Sie ein 12%iges Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Gel (SDS-PAGE) vor (siehe Materialtabelle). Bauen Sie das Gelelektrophoresegerät zusammen. Laden Sie die gleichen Mengen Protein jeder Probe in die SDS-PAGE-Gel-Wells. Stellen Sie die Elektrophoresespannung auf 80 V für die Konzentration und 100 V für die Trennung ein.
   4. Die Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran (siehe Materialtabelle) wird 1 Minute lang mit Methanol aktiviert, dann die PVDF-Membran in Transferpuffer eingeweicht, bevor Sie mit dem Transfer bei 100 V für 1 h fortfahren.
   5. Tauchen Sie die PVDF-Membran in TBST-Puffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl und 0,1 % Tween 20) ein, der 5 % Rinderserumalbumin (BSA; siehe Materialtabelle) enthält, und blockieren Sie dann für 30 Minuten.
   6. Die PVDF-Membran wird mit dem Primärantikörper über Nacht bei 4 °C auf einem Schüttler inkubiert. Die verwendeten primären Antikörper sind wie folgt: humanes Anti-CD63 (1:1000 Verdünnung), humanes Anti-CD9 (1:1000 Verdünnung) und humanes anti-HSP70 (1:1000 Verdünnung) (siehe Materialtabelle).
   7. Am nächsten Tag waschen Sie die PVDF-Membran fünfmal für jeweils 5 min mit TBST-Lösung und inkubieren Sie dann mit HRP-konjugierten Sekundärantikörpern (1:10000 Verdünnung) (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur (RT) für 1 h.
   8. Verwenden Sie nach fünfmaligem Waschen mit TBST ein Reagenz zur Chemilumineszenzdetektion für die Bildgebung auf einem Chemilumineszenzsystem.
3. Transmissionselektronenmikroskopie
   1. Geben Sie einen 20 μl PBS-verdünnten Probentropfen auf ein Wachspapier. Legen Sie dann ein Kupfergitter (siehe Materialtabelle) auf den Tropfen, so dass der Probentropfen das Kupfergitter abdecken kann, und lassen Sie es 20 Minuten lang bei RT stehen.
   2. Überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier aufsaugen. Fixieren Sie dann die Proben 2 Minuten lang in einer 20-μl-Lösung aus 2 % Paraformaldehyd, 2 % Glutaraldehyd und 0,05 M Phosphatlösung.
   3. Spülen Sie das Kupfergitter dreimal mit doppelt destilliertem Wasser und färben Sie es dann 1 Minute lang mit 20 μl 2%iger Phosphotungstinsäure (PTA) bei RT.
   4. Überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier aufsaugen. Trocknen Sie die Gitter über Nacht, bevor Sie sie mit der Transmissionselektronenmikroskopie analysieren (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Die empfohlenen Einstellungen für TEM lauten wie folgt: Belichtung: 1,0 s, HT-Spannung 100,00 kV, Strahlstrom: 50 μA, Spotgröße: 1, Modus: TEM. Diese Einstellungen können sich gemäß den Anweisungen des Herstellers ändern (siehe Materialtabelle).

Morphologische Charakterisierung von sEV
In der letzten Phase der Konzentration wurde auch die verschwendete Flüssigkeit wie beschrieben aufgefangen. Das konzentrierte Medium bzw. die verschwendete Flüssigkeit wurden ultrazentrifugiert. Wir haben die Ausfällungen für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) gesammelt. Wie erwartet, wurde eine signifikante Anzahl becherförmiger Nanovesikel in der Gruppe des konzentrierten Mediu...

Zu den traditionellen Methoden zur Isolierung von sEVs gehören die differentielle Ultrazentrifugation, die Größenausschlusschromatographie und die PEG-Fällung, die jeweils ihre eigenen Vor- und Nachteile haben. Während die Verschmelzung dieser unterschiedlichen Techniken die Ausbeute oder Reinheit von sEVs verbessern kann, bieten zusätzliche Schritte oft mehr Möglichkeiten für die Kontamination der Probe. Auf dem Markt sind integrierte Systeme entstanden, die behaupten, sEVs in g...

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation of China (822101167, bis BB) und der Natural Science Foundation of Chongqing (CSTB2022NSCQ-MSX0020 bis BB), dem Chongqing PhD "Through Train" Scientific Research Project of China (CSTB2022BSXM-JCX0031 bis BB) und der National Science Foundation of China (82271132 bis YL) unterstützt. Wir sind dankbar für die Unterstützung der Abteilung für Nephrologie, des ersten angeschlossenen Krankenhauses, der Dritten Militärmedizinischen Universität (Army Medical University) und des Instituts für Pathologie und des Southwest Cancer Center, des Southwest Hospital, der Dritten Militärmedizinischen Universität (Army Medical University) für die Ausrüstung und technische Unterstützung.