Выделение малых внеклеточных везикул, полученных из мезенхимальных стволовых клеток из образцов большого объема с соблюдением GMP для клинических исследований

Малые внеклеточные везикулы, полученные из мезенхимальных стволовых клеток (MSC-sEVs), были выделены как бесклеточный метод лечения с минимальными побочными эффектами. В этом исследовании представлен протокол, сочетающий гемодиализ с ультрацентрифугированием, что значительно сокращает время, затрачиваемое на весь процесс, и обеспечивает соответствие стандартам надлежащей производственной практики (GMP).

Малые внеклеточные везикулы (sEV), полученные из мезенхимальных стволовых клеток (MSC-sEVs), были выделены как бесклеточный метод лечения с минимальными побочными эффектами. Напротив, традиционные методы экстракции, такие как ультрацентрифугирование и эксклюзионная хроматография, ограничены их трудоемкостью, стоимостью и масштабируемостью. Для преодоления этих ограничений мы предлагаем метод, объединяющий гемодиализатор и ультрацентрифугирование. В этом подходе используется устройство для гемодиализа с мембраной для отсечения молекулярной массы (MWCO) с молекулярной массой 100 кДа, которое селективно концентрирует sEV, отфильтровывая при этом множество белков, тем самым повышая выход и чистоту sEV. За этой начальной стадией очистки следует ультрацентрифугирование для дальнейшего облагораживания препарата sEV. Интеграция этих двух технологий не только значительно сократила время, затрачиваемое на весь процесс, но и обеспечила соответствие стандартам надлежащей производственной практики (GMP). Данный метод демонстрирует высокую эффективность в выделении sEV из большого объема образцов, что является значительным шагом вперед по сравнению с традиционными методами. Этот протокол обещает ускорить внедрение методов лечения на основе электромобилей в клиническую практику за счет предоставления масштабируемого, экономически эффективного и соответствующего требованиям GMP решения.

Малые внеклеточные везикулы, полученные из мезенхимальных стволовых клеток (MSC-sEVs), представляют собой гетерогенные везикулы, обогащенные множеством компонентов, таких как мРНК, микро-РНК, цитокины, липиды и метаболиты¹. В последние годы многие исследования подчеркнули огромный терапевтический потенциал MSC-sEVs в качестве бесклеточного метода лечения с минимальными побочными эффектами², демонстрируя перспективность в лечении целого ряда заболеваний, включая старение, дегенерацию тканей, рак и воспалительные расстройства 3,4,5,6 . Тем не менее, при крупномасштабной экстракции sEV сохраняется серьезная проблема, при этом традиционные методы оказываются либо трудоемкими, либо экономически нецелесообразными. Кроме того, обеспечение воспроизводимости имеет первостепенное значение для клинического применения и трансляции методов лечения на основе ВВ⁷. Исследователи остро нуждаются в методе очистки, который был бы не только простым и эффективным, но и соответствовал бы стандартам надлежащей производственной практики (GMP)⁸.

Традиционные методы очистки, включая ультрацентрифугирование, ультрафильтрацию, эксклюзионную хроматографию, иммуноаффинность и осаждение полимеров, широко применялись в^{предыдущих исследованиях}. В целом, традиционные методы изоляции sEV имеют ограничения, такие как низкий уровень производительности, снижение чистоты и проблемы с соблюдением строгих асептических стандартов. Кроме того, в предыдущих исследованиях сообщалось о потенциале перспективных методов, таких как микрофлюидные системы^10,11, безметочная магнитная изоляция¹² и ковалентная химическая изоляция¹³, для достижения выдающихся характеристик. Тем не менее, потребность в специализированном оборудовании делает эти передовые методы сложными для большинства исследовательских групп. Таким образом, эффективный метод выделения sEV класса GMP из большого объема образцов остается критическим препятствием, ограничивающим прогресс многочисленных команд как в исследовательских, так и в клинических приложениях.

Ультрацентрифугирование является наиболее широко используемым методом выделения sEV и признано золотым стандартом метода ^14,15. Это метод, который использует различия в плотности и размере для выделения sEV. Изолированные sEV обычно промывают фосфатно-соевым буфером (PBS) для удаления остаточных загрязнений. Затем соответствующий объем PBS обычно используется для ресуспендирования промытых sEV, и различные ожидаемые концентрации sEV могут быть собраны путем регулирования объема PBS. Кроме того, сообщается, что чистота sEV плазмы, полученной ультрацентрифугированием, по-видимому, лучше, чем у sEV плазмы, выделенных методом эксклюзионной хроматографии (SEC), а sEV, полученные ультрацентрифугированием, имеют более низкое содержание примесей в невезикулярных внеклеточных частицах (NVEPs). Это также делает ультрацентрифугирование наиболее широко используемым и трудным для замены во многих видах лечения, требующих высоких концентраций sEV. Однако, помимо качества и чистоты, эффективность также является фактором, который нельзя игнорировать при крупносерийной экстракции sEV. До сих пор один раунд ультрацентрифугирования мог поддерживать объем образца примерно до 600 мл, что означает, что трудно удовлетворить спрос на крупномасштабную экстракцию только с помощью ультрацентрифугирования¹⁶.

Устройство для гемодиализа состоит из мембранного модуля, в котором размещаются тысячи полых волокон. Кровь циркулирует по этим волокнам в закрытой цилиндрической камере¹⁷. Составляющие крови могут избирательно проходить через эти мембраны в зависимости от их молекулярного размера и концентрации ионов. В клинике он широко используется в качестве искусственной почки для выведения продуктов жизнедеятельности и лишней жидкости из крови пациентов 18,19,20. Другими словами, гемодиализатор также обладает потенциалом для концентрирования образцов большого объема, полагаясь на процесс, аналогичный тангенциальной фильтрации потока (TFF). В недавнем руководстве, выпущенном Международным обществом внеклеточных везикул (ISEV), концентраты sEV считаются подходящими для образцов большого объема, таких как среда для культивирования клеток. После десятилетий разработки гемодиализаторы получили широкое распространение в больницах, чему способствует обилие зрелых расходных материалов и пул квалифицированных операторов, что облегчает поддержание стерильности образца.

В данном исследовании представлен метод очистки sEV на основе гемодиализатора и ультрацентрифуги, совместимых с GMP. В данном случае мы выбираем диализаторы с молекулярной массой 100 кДа (MWCO), которые, как было продемонстрировано, эффективно улавливают sEV и отфильтровывают многочисленные^белки22. Ультрацентрифугирование также обеспечивает этап для дальнейшей очистки. В работе показано, что гемодиализатор одинаково пригоден для концентрации sEVs. Этот протокол позволяет исследователям эффективно изолировать sEV из образцов большого объема. Мы зарегистрировали клиническое исследование в Китайском реестре клинических испытаний (ChiCTR, No ChiCTR2200059018), которое все еще продолжается и еще не завершено. Несмотря на то, что в настоящее время клинические данные не всегда доступны для публикации, надежный, крупномасштабный, эффективный и соответствующий требованиям метод производства sEV, как указано в этом протоколе, является необходимым условием для проведения доклинических и клинических испытаний.

Протокол был одобрен и проведен в соответствии с Комитетом по этике исследований человека Юго-Западной больницы.

1. Удаление клеточного мусора из питательной среды

ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенные ниже процедуры должны выполняться в среде, соответствующей требованиям GMP, особенно когда образцы могут подвергаться прямому воздействию окружающей среды.

1. Учитывая требование об отсутствии микробиоты, убедитесь, что фильтр и резиновая трубка автоклавированы для эффективной стерилизации. Убедитесь, что все другие расходные материалы, которые могут столкнуться с питательной средой, стерильны и упакованы в герметичную упаковку. Выполните процесс удаления клеточного мусора в ламинарном шкафу.
2. Установите фильтрующую мембрану размером 0,45 мкм и 0,22 мкм к фильтрующему аппарату. Подсоедините перистальтический насос (см. Таблицу материалов) и фильтрующее устройство с помощью резиновой трубки. Расположите мембрану 0,45 мкм над мембраной 0,22 мкм; в противном случае это может снизить эффективность фильтрации (Рисунок 1). Обратите внимание на различие между передней и тыльной сторонами микрофильтрационной мембраны.
3. Запустите перистальтический насос для фильтрации. Под действием насоса базальная среда мезенхимальных стволовых клеток (MSCBM) с 5% добавкой (см. Таблицу материалов) проходит через фильтр с одного конца, а отфильтрованная питательная среда может быть получена на другом конце фильтра, как показано на рисунке 1. Соберите отфильтрованную питательную среду в дренажный мешок с двойными каналами. Поддерживайте целостность системы фильтрации за счет оптимизации скорости перистальтического насоса и замены фильтрующей мембраны по мере необходимости.
4. После завершения фильтрации закройте впускной клапан на дренажном мешке и дополнительно запечатайте его парапленкой (см. Таблицу материалов). Перейдите к следующему этапу или временно храните отфильтрованную среду для клеточных культур при температуре 4 °C.

2. Концентрирование отфильтрованной питательной среды с помощью гемодиализатора

ПРИМЕЧАНИЕ: Воздержитесь от использования модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM), содержащей феноловый красный в клеточной культуре, так как детектор утечки крови в гемодиализаторе будет активирован, или отключите детектор утечки крови в настройках гемодиализатора.

1. Подготовьте расходные материалы.
   1. Перед концентрированием подготовьте кровные линии, высокопоточные полисульфоновые мембраны MWCO мощностью 100 кДа, диализатор крови, инфузионный набор, физиологический раствор, инфузионный мешок, раствор йода и ватные тампоны (см. Таблицу материалов).
2. Включите систему и проведите самодиагностику.
   1. Проверьте подключение кабеля питания гемодиализатора и включите основное питание.
   2. Подождите, пока аппарат завершит всю процедуру самодиагностики.
3. Установите кровные линии и диализатор.
   1. Проверьте сроки годности одноразовых кровных линий и диализатора крови, убедившись в целостности их внешней упаковки и проверив наличие повреждений линий.
   2. Установите трубки в том же направлении, что и кровоток в экстракорпоральном контуре, последовательно закрывая ответвления клапанов для формирования замкнутого круга кровообращения.
4. Начните процедуру полоскания.
   1. Используйте инфузионный набор для подключения физиологического раствора (без гепарина) из трубки перед насосом к контуру диализа. Подсоедините место сбора венозов к мешку для отработанной жидкости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Физиологический раствор не должен содержать гепарин или какие-либо другие антикоагулянты.
   2. Подсоедините линии подачи/возврата диализата к диализатору.
   3. Запустите гемодиализатор и установите скорость потока 80-100 мл/мин. Удалите весь воздух из диализного контура и диализатора, чтобы убедиться, что вся система трубок заполнена жидкостью.
   4. Отрегулируйте плоскость жидкости в артериальной и венозной камерах примерно на 2/3 полной. Физиологический раствор последовательно протекает через артериальную линию, диализатор, венозный катетер и мешок для отработанной жидкости.
5. Запустите ультрафильтрационную концентрацию.
   1. После окончания процедуры полоскания повесьте дренажный мешок, содержащий отфильтрованную питательную среду, на инфузионную стойку, продезинфицируйте выходной канал ватными палочками, пропитанными йодом, и подсоедините выходной канал дренажного мешка к порту предварительного насоса с помощью инфузионного набора.
   2. Соединяются артериальный порт и венозный порт кровных линий. Создайте изолированный контур ультрафильтрации (ISO-UF, ультрафильтрация без потока диализата) (рис. 1).
   3. Отрегулируйте целевой объем ультрафильтрации на диализном аппарате в соответствии с общим объемом жидкости, присутствующей в дренажном мешке. Установите время диализа ультрафильтрации на минимальное время работы системы. После успешной настройки параметров инициируйте ультрафильтрацию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В связи с расчетом системы гемодиализа, время диализа не будет слишком коротким, а будет поддерживаться на более умеренном уровне.
6. Получить концентрированную жидкость.
   1. После достижения целевого объема дегидратации закройте артериальный зажим и подсоедините венозный порт к стерильному инфузионному мешку.
   2. Откройте порт предварительной помпы одноразовых кровяных катетеров, оснащенных воздушным фильтром. Активируйте кровяной насос со скоростью около 50 мл/мин, позволяя жидкости в кровеносных линиях снова циркулировать от артериальной магистрали к венозной. Втяните всю концентрированную жидкость, примерно 158 мл, из контура обратно в стерильный инфузионный мешок.
   3. На поздней стадии концентрации соберите отработанную жидкость из линии возврата диализата. Применяйте последующие процессы, идентичные процессам концентрированной питательной среды, к образцу отработанной жидкости для мониторинга любой случайной потери sEV, которая могла произойти во время концентрирования.
   4. Закройте все клапаны и снимите инфузионный мешок, диализатор и все катетеры. Выключите электропитание и продезинфицируйте машину, протерев ее.

3. Разделение sEV с помощью ультрацентрифуги

1. Переложите концентрированную питательную среду в ультрацентрифужные пробирки, а затем сбалансируйте их.
2. Центрифугируйте в ультрацентрифуге клинического класса (см. Таблицу материалов) при давлении 110 000 × г в течение 70 мин, затем промойте гранулу стерильным физиологическим раствором и проведите второе центрифугирование при 110 000 × г в течение еще 70 мин.
3. Ресуспендируйте гранулированные sEV в соответствующем количестве стерильного физиологического раствора.
4. Перенесите sEV в стерильную пробирку для дальнейшего тестирования или храните их при температуре -80 °C для использования в будущем.

4. Характеристика полученных sEV

1. Анализ отслеживания наночастиц (NTA)
   1. Полученные sEVs (1 μL) разбавить PBS (1 мл) (см. Таблицу материалов). Отрегулируйте количество sEV, отображаемых в текущем поле зрения, в диапазоне от 50 до 200.
   2. Осторожно вводите разведенную пробу в пробу лунки, не допуская появления пузырьков воздуха.
   3. Выполняйте измерение, когда количество частиц в поле зрения максимально высокое и стабильное для всех положений. Параметры анализа: Максимальная площадь: 1000, Минимальная площадь: 10, Минимальная яркость: 30, Длина следа: 15, Температура: 25 °C, Чувствительность: 75.
   4. Измеряйте каждый образец не менее трех раз.
2. Анализ вестерн-блоттинга
   1. Разбавьте раствор sEVs в PBS. Используйте набор для анализа белка бицинхониновой кислоты (BCA) (см. Таблицу материалов) для измерения концентрации белка.
   2. Кипятите sEVs в буфере для образца при 100 °C в течение 5 минут.
   3. Приготовьте гель для электрофореза с 12% додецилсульфатом натрия и полиакриламидом (SDS-PAGE) (см. Таблицу материалов). Соберите аппарат для гель-электрофореза. Загрузите равное количество белка каждого образца в гелевые лунки SDS-PAGE. Установите напряжение электрофореза на 80 В для концентрации и 100 В для разделения.
   4. Активируйте мембрану из поливинилидендифторида (ПВДФ) (см. Таблицу материалов) метанолом в течение 1 мин, затем замочите мембрану из ПВДФ в буфере для переноса перед тем, как продолжить перенос при напряжении 100 В в течение 1 ч.
   5. Погрузите мембрану PVDF в буфер TBST (20 мМ Tris, 150 мМ NaCl и 0,1% Tween 20), содержащий 5% бычьего сывороточного альбумина (BSA; см. Таблицу материалов), а затем заблокируйте на 30 минут.
   6. Инкубируйте мембрану PVDF с первичным антителом в течение ночи при 4 °C на шейкере. Основными используемыми антителами являются следующие: человеческий анти-CD63 (разведение 1:1000), человеческий анти-CD9 (разведение 1:1000) и человеческий анти-HSP70 (разведение 1:1000) (см. Таблицу материалов).
   7. На следующий день мембрану PVDF промывают раствором TBST пять раз в течение 5 мин каждый, а затем инкубируют с HRP-конъюгированными вторичными антителами (разведение 1:10000) (см. Таблицу материалов) при комнатной температуре (RT) в течение 1 ч.
   8. После пятикратной промывки TBST используйте реагент для обнаружения хемилюминесценции для визуализации на хемилюминесцентной системе.
3. Просвечивающая электронная микроскопия
   1. Добавьте на вощеную бумагу каплю образца, разбавленную PBS, объемом 20 μл. Затем поместите медную сетку (см. Таблицу материалов) на каплю так, чтобы капля с образцом могла покрыть медную сетку, и оставьте ее на RT в течение 20 минут.
   2. Впитайте лишнюю жидкость с помощью фильтровальной бумаги. Затем зафиксируйте образцы в 20 мкл растворе 2% параформальдегида, 2% глутаральдегида и 0,05 М раствора фосфата на 2 мин.
   3. Медную решетку трижды промыть водой двойной дистилляции, затем окрасить 20 мкл 20 мкл 2% фосфовольфрамовой кислоты (ТФК) в течение 1 минуты при температуре RT.
   4. Впитайте лишнюю жидкость с помощью фильтровальной бумаги. Высушите сетки в течение ночи перед анализом с помощью просвечивающей электронной микроскопии (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемые настройки для TEM следующие: Экспозиция: 1,0 с, напряжение HT 100,00 кВ, Ток луча: 50 μA, Размер пятна: 1, Мода: TEM. Эти настройки могут изменяться в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).

Морфологическая характеристика sEVs
На заключительной стадии концентрирования также собирали отработанную жидкость, как описано. Концентрированную среду и отработанную жидкость подвергали ультрацентрифугированию соответственно. Мы соб...

Традиционные методы выделения sEV включают дифференциальное ультрацентрифугирование, эксклюзионную хроматографию и осаждение ПЭГ, каждый из которых имеет свои достоинства и недостатки. В то время как объединение этих разрозненных методов может повысить выход или чи...

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Эта работа была поддержана финансированием Национального научного фонда Китая (822101167, до BB) и Фонда естественных наук Чунцина (CSTB2022NSCQ-MSX0020 до BB), Чунцинского научно-исследовательского проекта Китая «Сквозной поезд» (CSTB2022BSXM-JCX0031 до BB) и Национального научного фонда Китая (82271132 до YL). Мы благодарны за помощь отделению нефрологии, Первому филиальному госпиталю, Третьему военно-медицинскому университету (Армейскому медицинскому университету), Институту патологии и Юго-Западному онкологическому центру, Юго-Западному госпиталю, Третьему военно-медицинскому университету (Армейскому медицинскому университету) за оборудование и техническую поддержку.