Mikroglia Gelişimi ile İnsan Beyni Organoidinin Türetilmesi

İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi hematopoietik progenitör hücreleri (HPC'ler) organoid gelişimine dahil ederek yerleşik mikroglialı bir insan beyni organoidi oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC) türetilen üç boyutlu (3D) beyin organoid kültürleri, insan beyninin gelişimini ve nörolojik hastalıkların patogenezini incelemek için in vitro önemli bir alternatif sağlar. Bununla birlikte, insan beyni organoidlerine mikroglia'nın dahil edilmemesi, nöroinflamasyonun 3D modelleri için hala büyük bir engeldir. Mevcut yaklaşımlar, ya tamamen farklılaşmış mikroglia'nın olgun beyin organoidlerine dahil edilmesini ya da iPSC'den türetilmiş embriyoid cisimciklerinin (EB'ler) erken evresinden mikroglial farklılaşmanın indüklenmesini içerir. İlk yaklaşım, mikroglial farklılaşmanın bitişik nöral çevre ile etkileşime girdiği aşamayı kaçırır ve daha sonraki yaklaşım teknik olarak zordur, bu da mikroglia miktarı ve kalitesi açısından nihai organoidler arasında tutarsızlığa neden olur. Mikroglial ve nöronal gelişim arasındaki erken etkileşimleri incelemek için beyin organoidlerini mikroglia ile modellemek için, insan iPSC'lerinden farklılaşan oldukça saf hematopoietik progenitör hücreler (HPC), beyin organoidleri yapmak için iPSC'den türetilmiş EB'lere dahil edildi. İmmün boyama ve tek hücreli RNA dizileme (sc-RNA-dizilimi) analizini kullanarak, HPC'lerin 3D organoidlere dahil edildiğini ve sonunda hem mikroglia hem de nöronlarla beyin organoidlerine dönüştüğünü doğruladık. HPC'leri olmayan beyin organoidleri ile karşılaştırıldığında, bu yaklaşım beyin organoidlerinde önemli mikroglial birleşme sağlar. Hem mikroglial hem de nöral gelişim özelliklerinden oluşan bu yeni 3D organoid model, doğuştan gelen bağışıklık ve sinir sistemi gelişimi arasındaki erken etkileşimleri incelemek için ve potansiyel olarak nöroinflamasyon ve nöroenfeksiyöz bozukluklar için bir model olarak kullanılabilir.

Mikroglia, beyinde bulunan ve hem beyin gelişiminde hem de homeostazda kritik rol oynayan yerleşik bağışıklık hücreleridir ^1,2. Mikroglia'nın aktivasyonu, proinflamatuar faktörlerin, yüksek fagositozun ve istilacı patojenleri ve tehlikeye atılmış hücreleri ortadan kaldıran reaktif oksidatif stresin üretilmesine neden olur. Bununla birlikte, mikroglia'nın aşırı aktivasyonu veya uzun süreli aktivasyonu, Parkinson hastalığı da dahil olmak üzere birçok nörolojik bozuklukta patogenez mekanizması olarak nörodejenerasyona neden olabilir ^3,4. Mikroglia'nın insan nörolojik bozukluklarını incelemek için ilgili modellere dahil edilmesi önemlidir. Son yıllarda, insan kök hücreleri, hayvan modellerine ve insan denek çalışmalarına alternatif olarak in vitro modeller olarak 3D organoidler geliştirmek için kullanılmaktadır⁵. İdeal olarak, insan organoidleri, insan fizyolojisini ve patogenezini hayvan modellerinden daha iyi temsil eden, ancak doğrudan insan bireyleri üzerinde yapılan çalışmalarda yer alan etik kaygılar olmadan, karşılık gelen insan organlarına benzer çoklu hücre tipleri ve doku yapıları oluşturur. Patogenez ve ilaç geliştirme çalışmaları ve bireyselleştirilmiş tedavilerin rehberliği için insan hastalık modellemesinin geleceğini temsil edebilirler⁶. Örnek olarak, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) türetilen 3D insan beyni organoidleri, ZIKA, SARS-CoV-2⁷ dahil olmak üzere nöral bulaşıcı hastalıkları ve amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve Alzheimer hastalığı ^8,9 dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıkları modelleyerek sinirbilim araştırmaları alanında hakim olmuştur. Bununla birlikte, nöronal farklılaşmayı indüklemek için çift SMAD inhibisyonu kullanan geleneksel 3D nöral organoidler 10, nöronların^11,12'den olduğu nöroektoderm soyu yerine kandan alınan progenitörlerden türetildikleri için mikrogliadan yoksun beyin organoidleri üretir. Mikroglia varlığı olmadan, organoidler CNS enfeksiyonlarını, iltihabı ve ilişkili nörodejenerasyonu modellemek için yetersizdir.

Bu kritik konuyu ele almak için, farklılaşmış mikroglia'yı beyin organoidlerine¹³ dahil etmek veya çift SMAD inhibisyonu¹³ yerine alternatif yaklaşımlar kullanarak organoidler içinde mikroglial farklılaşmayı indüklemek için girişimlerde bulunulmuştur. Bununla birlikte, farklılaşmış mikroglia'yı beyin organoidlerine dahil ederek, nöronal ve mikroglial gelişim arasındaki erken etkileşimler gözden kaçar. Bu, CNS gelişiminde veya ZIKA virüsü enfeksiyonu¹⁴ gibi bebek beyin gelişimini hedef alan nöroenfeksiyöz bozuklukların patogenezinde önemli olabilir. Öte yandan, iPSC'den türetilmiş beyin organoidleri içindeki doğuştan gelen mikroglia'nın aralıklı aşamalar olmadan ayırt edilmesi, uzun süreli bir süreci içerir ve son ürünler içinde daha yüksek değişkenliğe sahiptir¹⁵. Bildirilen bu protokolde, iPSC'den türetilen hematopoietik progenitör hücreleri (HPC'ler), hem nöronlar hem de mikroglia dahil olmak üzere 3D organoidlere daha da farklılaşan embriyoid cisimcikleri (EB'ler) yapmak için iPSC'lere dahil ettik.

Protokolümüz, erken nöron-mikroglial etkileşimleri içeren insan merkezi sinir sistemini ve nöral enfeksiyöz bozuklukların patogenezini ve mikroglial aktivasyonu içeren nöroinflamasyonu incelemek için benimsenebilecek kolay bir yaklaşım sunmaktadır.

Sağlıklı yetişkin donörlerden alınan orijinal kan örnekleri NIH Transfüzyon Tıbbı Kan Bankası'nda toplandı ve NIH Kurumsal İnceleme Kurulu'na uygun olarak imzalı bilgilendirilmiş onam formları alındı.

1. İnsan iPSC'lerinden hematopoietik progenitör hücrelerin (HPC'ler) üretilmesi

NOT: Temsili sonuçları üretmek için insan iPSC hücreleri 510 ve 507 kullanıldı. iPSC'lerin üretim ve bakım yöntemleri önceki bir yayında^{bulunabilir 16}.

1. 0. Gün: DMEM / F12 ortamında seyreltilmiş 500 μL / kuyu buz gibi soğuk Matrigel (bazal membran matrisi [BMM]) çözeltisi ekleyerek 12 oyuklu bir hücre plakasını kaplayın ve oda sıcaklığında (RT) en az 30 dakika inkübe edin.
2. Kaplama süpernatantını tamamen çıkarın ve oyuk başına 1 mL E8 Flex ortamı ile değiştirin.
3. iPSC'lerin yüksek kalitede olduğunu ve farklılaşma belirtisi olmadığını doğrulamak için mikroskop altında 6 oyuklu bir plakadaki iPSC kültürünü kontrol edin. Plakanın alt kısmının altında bir işaretleyici kalemle işaretleyerek orta büyüklükte bir koloni seçin.
4. Ortamı iPSC kültüründen çıkarın ve kuyucuğa 500 μL etilendiamintetraasetik asit (EDTA) iPSC ayrışma tamponu (0.5 mM EDTA, DPBS'de 0.45 g/L NaCl) ekleyin.
5. Koloninin kenarlarından üç ila dört sıra hücre küçülmeye başladığında ve hücreler arasında boş alan göründüğünde hücre ayrışması belirtileri için mikroskop altında gözlemleyin. Bu genellikle 1-3 dakika sürer.
6. EDTA çözeltisini tamamen atın. 1 mL E8 Flex ortamını kuvvetlice ve doğrudan üzerine pipetleyerek işaretli iPSC kolonisini yerinden çıkarın. 1-3 kez pipetlemeden sonra koloninin her biri 20-50 hücre içeren hücre yamalarına tamamen ayrıldığından emin olun.
7. Süpernatan içeren hücre yamalarını toplayın ve 12 oyuklu plakadaki kaplanmış oyukların ilk oyuğuna ekleyin.
8. Kuyuyu bir veya iki kez pipetleyerek karıştırın ve 1 mL hücreyi 1 mL ortam içeren ikinci kuyucuğa aktarın.
9. Toplam dört kuyucukta seri seyreltilmiş iPSC kültürleri yapmak için adım 1.8'i iki kez tekrarlayın.
10. Plakayı 37 °C, %5 CO2 inkübatörde inkübe edin.
11. 24 saat sonra, 1. günde, mikroskop altında kolonileri kontrol edin ve bir kuyudaki tüm tarlalardan sürekli olarak geçerek koloni sayılarını sayın. 10-20 iPSC kolonisi içeren bir kuyu seçin.
12. Ortamı hematopoietik Kitten 1 mL ortam A ile değiştirin. Plakayı 48 saat boyunca inkübatöre geri koyun.
13. 3. günde, 500 μL kullanılmış ortamı çıkarın ve 500 μL taze ortam A ekleyin.
14. 4. günde, mikroskop altında gözlemleyin ve iPSC kolonilerinden önemli hücre büyümesi ve farklılaşması fark edin. Ortamı 1 mL ortam B ile değiştirin.
15. Mikroskop altında hücre farklılaşmasını izleyin ve her gün 500 μL Orta B ile yarı-orta değişim yapın. HPC benzeri hücreler 6-7. günlerde ortaya çıkar.
16. 10. günde, mikroskop altında, ortamda yüzen normal HPC'lerin morfolojisine sahip veya bazı gevşek hücre agregatları ile düz hücrelerin tek alt tabakasına gevşek bir şekilde bağlanmış parlak tek yuvarlak hücreleri gözlemleyin.
    NOT: Farklılaştırılmış HPC'ler, karakterizasyon veya daha fazla deney için toplanmaya hazırdır.
17. Hücre agregalarını kırmak ve HPC'leri plaka yüzeyinden ayırmak için 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek tüm farklılaşmış HPC'leri toplayın.
18. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpe ekleyin ve hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 1 mL ortam B'ye yeniden süspanse edin.
19. Hücreleri sayın ve konsantrasyonu 1 milyon hücre / mL'ye ayarlayın. Bu aşamada, 1 milyondan fazla HPC üretilir. Akış sitometrisi ile kontrol edildiğinde, saflığın CD34 + / CD43 + içeren hücrelerin% 85'inden fazla olduğundan emin olun. Önemli ölü hücrelerin (% 5'ten fazla) fark edilmediğinden emin olun.

2. Karışık iPSC'lerden ve HPC'lerden embriyoid cisimlerin geliştirilmesi

1. HPC'lerin toplandığı aynı gün, bir iPSC kültürünün de 6 oyuklu bir plakadaki bir kuyucukta (veya 12 oyuklu bir plakadaki iki kuyucukta) %80 birleşmeye ulaştığından emin olun.
2. EB oluşumu için mikrokuyu kültür plakasının bir kuyusunu, kabarcıkları en aza indirmek için ekleyerek 500 μL yapışma önleyici durulama solüsyonu ile işlemden geçirin.
3. Olası kabarcıkları gidermek için plakayı plaka tutucularla donatılmış sallanan bir kova rotorunda 5 dakika boyunca 2000 x g'da döndürün.
4. Durulama solüsyonunu pipetleyerek tamamen çıkarın ve kuyucukları kabarcık oluşturmadan 1 mL DPBS ve ardından 1 mL DMEM/F12 ile iki kez yıkayın.
5. Hücreleri 1 mL Accutase çözeltisi ile muamele ederek iPSC'leri plakadan ayırın.
6. Hücreler ayrılma belirtileri gösterene ancak hala dibe bağlı olana kadar mikroskop altında gözlemleyin. Bu genellikle Accutase tedavisinden 1-3 dakika sonra olur. iPSC'leri aşırı sindirmeyin.
7. Accutase solüsyonunu hücreleri rahatsız etmeden tamamen çıkarın ve kuyucuklara 1 mL DMEM / F12 ortamı ekleyin. Ayrıca, 1 mL'lik bir uç kullanarak birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri tek hücrelere ayırın.
8. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpe toplayın ve DMEM / F12 ortamı ile 5 mL'ye doldurun. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
9. Süpernatanı pipetleyerek çıkarın ve hücreleri 1 mL E8 Flex ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri sayın ve hücre konsantrasyonunu E8 Flex ortamında mL başına 1 milyon hücreye ayarlayın.
10. 1 milyon iPSC (1 mL) ve yarım milyon HPC (500 μL) ekleyerek iPSC'leri HPC'lerle 2:1 oranında karıştırın. Tüm karışık hücreleri, mikrokuyu kültür plakasının önceden işlenmiş kuyucuğuna ekleyin.
11. Süpernatanıma 1 mL ortam başına 1 μL Kaya inhibitörü Y27632 stok çözeltisi (1 mM) ekleyin. Hücreleri eşit şekilde dağıtmak için plakayı birkaç kez bir yandan diğer yana sallayın.
12. Mikrokuyu kültür plakasını, plaka tutucularla donatılmış sallanan bir kova rotorunda 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün. Hücrelerin mikro kuyulara yerleşip yerleşmediğini görmek için mikroskop altında gözlemleyin. (Ek Şekil 1A).
13. Hücreleri rahatsız etmeden, plakayı 37 °C,% 5 CO₂ hücre inkübatörüne koyun.
14. 2. günde, 48 saat sonra, EB'lerin oluşumu için mikroskop altında hücreleri gözlemleyin. EB'ler net bir şekilde oluştuğunda, bir sonraki adıma geçin (Ek Şekil 1B).
15. Düşük bir bağlantı plakası yapmak için 24 oyuklu bir hücre kültürü plakasını yapışma önleyici durulama tamponu (500 μL) ile 15 dakika boyunca tedavi edin.
16. Durulama tamponunu tamamen çıkarın ve kuyucukları 1 mL DPBS ile iki kez yıkayın, ardından kuyucuklara 1 mL E8 Flex ortamı ekleyin.
17. EB'leri mikrokuyu kültür plakasında 1 mL genişliğinde delikli bir pipet ucu ile birkaç kez pipetleyerek yeniden süspanse edin.
18. Düşük yapışma ile muamele edilmiş 24 kuyucuk plakasının her bir oyuğu için, EB'ler içeren 100 μL ortam toplayın ve ekleyin. Bu, kuyu başına 10-20 EB ile sonuçlanacaktır. Kalan EB'leri yedek olarak içeren eski kuyuya E8 Flex medium'u ekleyin.
19. Plakayı 37 °C,% 5 CO₂ hücreli inkübatörde 48 saat inkübe edin.

3. 3D nöral organoid indüksiyon, proliferasyon ve olgunlaşma

1. EB oluşumundan sonraki 2. günde, BMM'nin alikotlarını buz üzerinde en az 30 dakika boyunca çözdürün.
2. Önceden soğutulmuş 20 μL'lik bir uç kullanın ve EB'leri kaplamak için ortamın üzerine akıllıca 15 μL buz gibi BMM damlası ekleyin. Bu, EB'lerin bağlanacağı ve üzerine büyüyeceği bir BMM filmi yapar.
3. Plakayı 37 °C,% 5 CO₂ hücreli inkübatöre koyun.
4. 4. günde, EB oluşumundan sonra, EB'leri atmadan 500 μL ortamı dikkatlice çıkarın ve adım 3.2'yi izleyerek BMM kaplamasını tekrarlayın.
5. Hücrelerin üzerine 500 μL PSC Nöral İndüksiyon Ortamı ekleyerek hemen nöral indüksiyonu başlatın.
6. 6. ve 8. günlerde, hücrelere dokunmadan 500 μL ortamı dikkatlice çıkararak ve 500 μL nöral indüksiyon ortamı ekleyerek yarı orta değişim gerçekleştirin.
7. 10, 12 ve 14. günlerde, nöral kök hücre (NSC) ortamı ile yarı orta değişim gerçekleştirin: Nakavt DMEM / F12 + 1x Glutamax takviyesi + 1x Nöral takviye + bFGF + EGF.
8. 15. günde, orta dereceli kürelerin tamamını, daha önce tarif edildiği gibi yapışma önleyici durulama çözeltisi ile muamele edilmiş yeni bir 12 oyuklu plakaya aktarın. Kültürün üzerine 500 μL nöronal olgunlaşma ortamı (DMEM/F12 + 1x N2 takviyesi + 1x B27 takviyesi + 1x antibiyotik-antimikotik) ekleyin.
9. Her gün nöronal olgunlaşma ortamı ile yarı-orta değişim yapın.
10. Olgunlaşma aşamasında, ortamın renk değişimi gibi beslenme tükenmesi belirtileri varsa, organoidi oyuk başına 3 mL'ye kadar ortam tutan 6 oyuklu plakaya taşıyın.
11. İsteğe bağlı olarak, EB oluşumundan 17 gün sonra, mikroglial olgunlaşmayı kolaylaştırmak için olgunlaşma ortamını 6 gün boyunca sitokinlerle (IL-34, M-CSF, TGF-β1, CD200, CX3CL1) destekleyin.
12. 23. günde, karakterizasyon veya daha ileri deneyler için elde edilen nöral organoidleri toplayın.

4. 3D nöral organoidlerin temizlenmesi ve immün boyanması

1. 24 saat boyunca 4 ° C'de 1 mL %4 paraformaldehit (PFA) içine daldırarak 10'a kadar organoidi sabitleyin.
2. Organoidleri oyuk başına 96 oyuklu şeffaf bir alt plakaya aktarın ve 200 μL DPBS ile her seferinde 1 saat boyunca 2 kez hafifçe çalkalayarak yıkayın.
3. Organoidleri DPBS'de %50 metanol, çift damıtılmış (dd) suda %80 metanol ve %100 kuru metanol içinde her biri 10 dakika boyunca 4 °C'de hafifçe çalkalayarak geçirgen hale getirin.
4. Organoidleri seri olarak %20 DMSO / metanol,% 80 metanol dd suda,% 50 metanol DPBS'de,% 100 DPBS'de, daha sonra% 0.2 Triton X-100 ile DPBS'de, her biri 10 dakika boyunca 4 ° C'de hafifçe çalkalayarak yıkayın. Her yıkamadan sonra kalan tamponu tamamen çıkarmak için çaba gösterin.
5. RT'de 40 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak geçirgen tamponda (% 0.2 Triton X100, 0.3 M glisin ve% 20 DMSO ile DPBS) inkübe edin.
6. 37 ° C'de 1 saat boyunca 80 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde hafifçe çalkalayarak bloke edici tamponu (% 0.2 Triton X100,% 6 Keçi serumu ve% 10 DMSO ile DPBS) bloke edin.
7. Antikor seyreltme tamponunda antikorlarla inkübe edin (IBA1 1:100, TREM2 1:100, βIII-tubulin, 1:1000, 100 μL / kuyu DPBS'de %0.2 Tween 20, 100 μg/mL Heparin, %3 Keçi serumu ve %5 DMSO) 37 ° C'de 2 saat veya 3 gün boyunca 80 rpm'de hafifçe çalkalama ile soğuk odada.
8. DPBS ile %0,2 Tween 20, 100 μg/mL Heparin ile 5 kez, her biri RT'de 10 dakika süreyle 80 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde hafifçe çalkalayarak yıkayın.
9. İkincil antikor (1:200 keçi anti-fare Alexa488) ile 37 ° C'de 1 saat inkübe edin, ardından gece boyunca 80 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde hafifçe çalkalayarak RT yapın.
10. Nükleer kontrast boyama için, DAPI boyamayı antikor inkübasyonu ile birlikte veya bir yıkama tamponunda gerçekleştirin.
11. Organoidleri yıkama tamponunda 10 kez, her seferinde 10 dakika 37 °C'de hafifçe çalkalayarak yıkayın.
12. Mikroskop altında gözlemleyin. Arka plan hala yüksekse, 5 kez yıkamaya devam edin.
13. Süpernatanı mümkün olduğunca atın. 200 μL organoid temizleme solüsyonu ekleyin ve gözlemden önce 5 dakika inkübe edin ve konfokal mikroskop kullanarak görüntü alın.

Protokolümüz, HPC'leri iPSC'lerden ayırmak ve ardından EB'ler yapmak için HPC'leri iPSC'lerle karıştırmak, ardından nöral indüksiyon, farklılaşma ve olgunlaşmak için bir şema izler (Şekil 1). Yüksek kaliteli HPC farklılaşması, EB oluşumunun ve daha sonra organoid farklılaşmasının başarısı için kritik öneme sahiptir. HPC farklılaşmasını başlatmak için uygun sayıda ve boyutta iPSC koloniler...

Burada, karışık iPSC'lerden ve iPSC ile farklılaşmış HPC'lerden türetilen EB'lerden doğuştan gelen mikroglia içeren 3D nöral organoidlerin yapılması için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Çoğu laboratuvarda genel olarak bulunan yalnızca hücre kültürü tekniklerini ve ekipmanlarını içeren nispeten kısa ve kolay bir yaklaşımdır.

Bu protokolün başarısı için en kritik faktör, HPC farklılaşmasının kalitesidir. Bazı de?...

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bu çalışma NINDS intramural araştırma fonları tarafından desteklenmektedir.