Microglia 발달을 통한 인간 뇌 오가노이드의 유도

우리는 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 조혈전구세포(HPC)를 오가노이드 개발에 통합하여 상주 미세아교세포를 가진 인간 뇌 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 제시합니다.

유도만능줄기세포(iPSC)에서 유래한 3차원(3D) 뇌 오가노이드 배양은 인간의 뇌 발달 및 신경 질환의 발병을 연구하기 위한 중요한 체외 도구를 제공합니다. 그러나 인간 뇌 오가노이드에 미세아교세포가 통합되지 않은 것은 여전히 신경염증의 3D 모델에 대한 주요 장애물입니다. 현재의 접근법에는 완전히 분화된 미세아교세포를 성숙한 뇌 오가노이드에 통합하거나 iPSC 유래 배아체(EB)의 초기 단계에서 미세아교세포를 분화시키는 것이 포함됩니다. 첫 번째 접근 방식은 미세아교세포 분화가 인접한 신경 환경과 상호 작용하는 단계를 놓치고, 두 번째 접근 방식은 기술적으로 까다로워 미세아교세포의 양과 품질 측면에서 최종 오가노이드 간에 불일치가 발생합니다. 미세아교세포와 신경세포 발달 사이의 초기 상호작용을 연구하기 위해 미세아교세포를 이용한 뇌 오가노이드를 모델링하기 위해, 인간 iPSC와 분화된 고순도 조혈전구세포(HPC)를 iPSC 유래 EB에 통합하여 뇌 오가노이드를 만들었습니다. 면역염색 및 단세포 RNA 염기서열분석(sc-RNA-seq) 분석을 통해 HPC가 3D 오가노이드에 통합되었으며, 이는 결국 미세아교세포와 뉴런을 모두 가진 뇌 오가노이드로 발전했음을 확인했습니다. HPC가 없는 뇌 오가노이드와 비교했을 때, 이 접근법은 뇌 오가노이드에 상당한 미세아교세포 통합을 생성합니다. 미세아교세포와 신경 발달 특성으로 구성된 이 새로운 3D 오가노이드 모델은 선천성 면역 및 신경계 발달 간의 초기 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있으며 잠재적으로 신경 염증 및 신경 감염 질환의 모델로 사용될 수 있습니다.

미세아교세포(Microglia)는 뇌의 상주 면역 세포로, 뇌 발달과 항상성 모두에 중요한 역할을 합니다 ^1,2. 미세아교세포의 활성화는 전염증 인자, 식세포작용 증가, 반응성 산화 스트레스를 생성하여 침입하는 병원체와 손상된 세포를 제거합니다. 그러나, 미세아교세포의 과잉 활성화 또는 장시간 활성화는, 다른 한편으로는, 파킨슨병을 포함하여 많은 신경학상 무질서에 있는 병인의 기전으로 neurodegeneration를 일으키는 원인이 될지도 모른다 ^3,4. 미세아교세포가 인간의 신경 질환을 연구하기 위한 관련 모델에 포함되는 것이 중요합니다. 최근 몇 년 동안 인간 줄기세포는 동물 모델 및 인간 피험자 연구의 대안으로 체외 모델과 같은 3D 오가노이드를 개발하는 데 사용되었습니다⁵. 이상적으로, 인간 오가노이드는 해당 인간 장기와 유사한 여러 세포 유형 및 조직 구조를 구성하여 동물 모델보다 인간의 생리학 및 발병기전을 더 잘 나타내지만 인간 개인에 대한 연구와 직접 관련된 윤리적 문제는 없습니다. 이는 발병 기전 및 약물 개발 연구와 개별화된 치료법의 안내를 위한 인간 질병 모델링의 미래를 나타낼 수 있습니다⁶. 예를 들어, 인간 유도 만능 줄기세포(iPSC)에서 유래한 3D 인간 뇌 오가노이드는 신경 과학 연구 분야에서 널리 사용되고 있으며, ZIKA, SARS-CoV-2⁷ 및 근위축성 측삭 경화증(ALS) 및 알츠하이^머병8,9을 포함한 신경 퇴행성 질환을 포함한 신경 감염 질환을 모델링합니다. 그러나 뉴런 분화¹⁰를 유도하기 위해 이중 SMAD 억제를 사용하는 기존의 3D 신경 오가노이드는 뉴런이^11,12에서 유래한 신경 외배엽 계통 대신 혈액에서 모집된 전구세포에서 파생되기 때문에 미세아교세포가 결핍된 뇌 오가노이드를 생성합니다. 미세아교세포가 없으면 오가노이드는 CNS 감염, 염증 및 관련 신경 퇴행을 모델링하기에 부적절합니다.

이 중요한 문제를 해결하기 위해 분화된 미세아교세포를 뇌 오가노이드에 통합하거나(¹³ ) 이중 SMAD 억제¹³ 대신 대체 접근법을 사용하여 처음부터 오가노이드 내에서 미세아교세포의 분화를 유도하려는 시도가 있었습니다. 그러나 분화된 미세아교세포를 뇌 오가노이드에 통합함으로써 뉴런과 미세아교세포 발달 사이의 초기 상호 작용은 놓치게 됩니다. 이는 중추신경계(CNS) 발달 또는 지카 바이러스 감염과 같이 유아의 뇌 발달을 표적으로 하는 신경감염성 질환의 발병에 중요할 수 있다¹⁴. 반면에, 간헐적 단계 없이 iPSC 유래 뇌 오가노이드 내에서 선천성 미세아교세포를 분화하는 것은 장기간의 과정을 수반하며 최종 산물 내에서 더 높은 변동성을 갖습니다¹⁵. 이 보고된 프로토콜에서는 iPSC 유래 조혈전구세포(HPC)를 iPSC에 통합하여 배아체(EB)를 만들었으며, 이는 뉴런과 미세아교세포를 모두 포함하는 3D 오가노이드로 더욱 분화되었습니다.

당사의 프로토콜은 초기 뉴런-미세아교세포 상호 작용과 관련된 인간 중추 신경계와 미세아교세포 활성화와 관련된 신경 감염 장애 및 신경 염증의 발병 기전을 연구하기 위해 채택할 수 있는 쉬운 접근 방식을 제공합니다.

건강한 성인 기증자의 원본 혈액 샘플은 NIH의 수혈 의학 혈액 은행에서 수집되었으며, NIH 기관 검토 위원회에 따라 서명된 정보에 입각한 동의서를 입수했습니다.

1. 인간 iPSC에서 조혈전구세포(HPC) 생산

참고: 대표적인 결과를 생성하기 위해 인간 iPSC 세포(510 및 507)를 사용했습니다. iPSC의 생성 및 유지 방법은 이전 간행물¹⁶에서 확인할 수 있습니다.

1. Day 0: DMEM/F12 배지로 희석된 얼음처럼 차가운 Matrigel(기저막 매트릭스[BMM]) 용액 500μL/웰을 첨가하여 12웰 셀 플레이트를 코팅하고 실온(RT)에서 최소 30분 동안 배양합니다.
2. 코팅 상층액을 완전히 제거하고 웰당 1mL의 E8 Flex 배지로 교체합니다.
3. 현미경으로 6웰 플레이트의 iPSC 배양을 확인하여 iPSC가 고품질이며 차별화 징후가 없는지 확인합니다. 중간 크기의 군락을 선택하여 접시 바닥 아래에 마커 펜으로 표시하십시오.
4. iPSC 배양액에서 배지를 제거하고 500μL의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) iPSC 해리 완충액(0.5mM EDTA, DPBS의 0.45g/L NaCl)을 웰에 추가합니다.
5. 현미경으로 세포 해리의 징후가 있는지 관찰하면 군체의 가장자리에서 3-4줄의 세포가 줄어들기 시작하고 세포 사이에 빈 공간이 나타납니다. 일반적으로 1-3분 정도 걸립니다.
6. EDTA 용액을 완전히 폐기하십시오. E8 Flex 배지 1mL를 강력하게 직접 피펫팅하여 표시된 iPSC 콜로니를 제거합니다. 1-3회의 피펫팅 후 각각 20-50개의 세포를 포함하는 세포 패치로 콜로니가 완전히 분리되는지 확인합니다.
7. 세포 패치를 포함하는 상층액을 수집하여 12웰 플레이트에 있는 코팅된 웰의 첫 번째 웰에 추가합니다.
8. 1회 또는 2회 피펫팅하여 웰을 혼합하고 1mL의 배지를 포함하는 두 번째 웰로 1mL의 세포를 옮깁니다.
9. 1.8단계를 두 번 반복하여 총 4개의 웰에서 연속 희석된 iPSC 배양을 만듭니다.
10. 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다.
11. 24시간 후, 1일차에 현미경으로 군체를 확인하고 우물의 모든 밭을 지속적으로 통과하여 군체의 수를 계산합니다. 10-20개의 iPSC 콜로니가 포함된 웰 하나를 선택합니다.
12. 배지를 조혈 키트의 배지 A 1mL로 교체합니다. 플레이트를 인큐베이터에 다시 48시간 동안 넣습니다.
13. 3일차에 사용한 배지 500μL를 제거하고 새로운 배지 A 500μL를 추가합니다.
14. 4일차에 현미경으로 관찰하고 iPSC 콜로니에서 상당한 세포 성장과 분화를 확인합니다. 배지를 1mL의 배지 B로 교체합니다.
15. 현미경으로 세포 분화를 모니터링하고 격일로 500μL의 배지 B로 반배지 변화를 수행합니다. HPC와 유사한 세포는 6-7일에 나타납니다.
16. 10일째에는 현미경으로 정상적인 HPC의 형태가 배지에 떠다니거나 편평한 세포의 단일 바닥 층에 느슨하게 부착되어 있고 일부 느슨한 세포 응집체가 있는 밝은 단원형 세포를 관찰합니다.
    참고: 차별화된 HPC는 특성화 또는 추가 실험을 위해 수집할 준비가 되어 있습니다.
17. 1mL 피펫 팁을 사용하여 위아래로 세 번 피펫팅하여 세포 응집체를 파괴하고 플레이트 표면에서 HPC를 분리하여 분화된 모든 HPC를 수집합니다.
18. 세포를 15mL 튜브에 넣고 300 x g 에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 1mL의 배지 B에 재현탁합니다.
19. 세포 수를 세고 농도를 100만 cells/mL로 조정합니다. 이 단계에서 100만 개 이상의 HPC가 생성됩니다. 유세포 분석으로 확인할 때 순도가 CD34+/CD43+인 세포의 85% 이상인지 확인하십시오. 유의미한 죽은 세포(5% 이상)가 발견되지 않도록 합니다.

2. 혼합 iPSC 및 HPC로부터 배아체 개발

1. HPC를 채취한 당일, iPSC 배양이 6웰 플레이트의 한 웰(또는 12웰 플레이트의 웰 2개)에서 80% 합류에 도달하는지 확인합니다.
2. EB 형성을 위한 마이크로웰 배양 플레이트의 한 웰에 500μL의 접착 방지 헹굼 용액을 첨가하여 기포를 최소화하여 처리합니다.
3. 플레이트 홀더가 장착된 스윙 버킷 로터에서 2000 x g 에서 5분 동안 플레이트를 회전시켜 가능한 기포를 제거합니다.
4. 피펫팅으로 헹굼 용액을 완전히 제거하고 기포 없이 1mL의 DPBS와 1mL의 DMEM/F12로 웰을 두 번 세척합니다.
5. 1mL의 Accutase 용액으로 세포를 처리하여 플레이트에서 iPSC를 분리합니다.
6. 세포가 분리의 징후를 보이지만 여전히 바닥에 붙어 있을 때까지 현미경으로 관찰하십시오. 이것은 일반적으로 Accutase 치료 후 1-3분 이내에 발생합니다. iPSC를 과도하게 소화하지 마십시오.
7. 세포를 방해하지 않고 Accutase 용액을 완전히 제거하고 1mL의 DMEM/F12 배지를 well에 추가합니다. 또한, 1mL 팁을 사용하여 위아래로 두 번 피펫팅하여 세포를 단일 세포로 해리합니다.
8. 세포를 15mL 튜브에 모으고 DMEM/F12 배지로 5mL까지 채웁니다. 300 x g 에서 5분 동안 셀을 회전시킵니다.
9. 피펫팅으로 상층액을 제거하고 1mL의 E8 Flex 배지에 세포를 재현탁합니다. 세포를 계수하고 E8 Flex 배지에서 세포 농도를 mL당 100만 개의 세포로 조정합니다.
10. 100만 개의 iPSC(1mL)와 50만 개의 HPC(500μL)를 함께 첨가하여 iPSC와 HPC를 2:1의 비율로 혼합합니다. 모든 혼합 세포를 마이크로웰 배양 플레이트의 이전에 처리된 웰에 추가합니다.
11. 1mL 배지당 1μL의 Rock inhibitor Y27632 원액(1mM)을 상층액에 추가합니다. 플레이트를 좌우로 몇 번 흔들어 세포를 고르게 분포시킵니다.
12. 플레이트 홀더가 장착된 스윙 버킷 로터에서 300 x g 의 속도로 마이크로웰 배양 플레이트를 5분 동안 회전시킵니다. 세포가 마이크로웰에 정착했는지 확인하기 위해 현미경으로 관찰합니다. (보충 그림 1A).
13. 세포를 방해하지 않고 플레이트를 37°C, 5% CO₂ 세포 배양기에 넣습니다.
14. 2일차, 48시간 후, EB의 형성을 위해 현미경으로 세포를 관찰합니다. EB가 명확하게 형성되면 다음 단계를 계속합니다(보충 그림 1B).
15. 24웰 세포 배양 플레이트를 접착 방지 헹굼 버퍼(500μL)로 15분 동안 처리하여 부착 플레이트를 낮춥니다.
16. 헹굼 버퍼를 완전히 제거하고 1mL의 DPBS로 웰을 두 번 세척한 다음 1mL의 E8 Flex 배지를 웰에 추가합니다.
17. 1mL 너비의 오리피스 피펫 팁으로 EB를 몇 차례 피펫팅하여 마이크로웰 배양 플레이트에 EB를 재현탁시킵니다.
18. 낮은 접착력 처리된 24웰 플레이트의 각 웰에 대해 EB를 포함하는 배지 100μL를 수집하고 추가합니다. 이로 인해 유정당 10-20EB가 발생합니다. 남은 EB를 백업으로 포함하는 오래된 우물에 E8 Flex 매체를 추가합니다.
19. 플레이트를 37°C, 5% CO₂ 세포 배양기에서 48시간 동안 배양합니다.

3. 3D 신경 오가노이드 유도, 증식 및 성숙

1. EB 형성 후 2일차에 BMM의 분취액을 얼음 위에서 최소 30분 동안 해동합니다.
2. 사전 냉각된 20μL 팁을 사용하고 매체 위에 15μL 얼음처럼 차가운 BMM 드롭을 현명하게 추가하여 EB를 코팅합니다. 이것은 EB가 부착하고 성장할 BMM의 필름을 만듭니다.
3. 플레이트를 37°C, 5% CO₂ 세포 배양기에 넣습니다.
4. 4일차에 EB 형성 후 EB를 버리지 않고 500μL의 배지를 조심스럽게 제거하고 3.2단계에 따라 BMM 코팅을 반복합니다.
5. 세포 위에 500μL의 PSC 신경 유도 배지를 추가하여 즉시 신경 유도를 시작합니다.
6. 6일차와 8일차에 세포를 건드리지 않고 500μL의 배지를 조심스럽게 제거하고 500μL의 신경 유도 배지를 추가하여 절반의 배지 변경을 수행합니다.
7. 10일, 12일, 14일째에 신경줄기세포(NSC) 배지로 반배지 변화를 수행합니다: Knockout DMEM/F12 + 1x Glutamax 보충제 + 1x 신경 보충제 + bFGF + EGF.
8. 15일째에 배지가 있는 구의 전체 웰을 앞서 설명한 대로 접착 방지 헹굼 용액으로 처리된 새 12웰 플레이트로 옮깁니다. 배양 위에 500μL의 신경 성숙 배지(DMEM/F12 + 1x N2 보충제 + 1x B27 보충제 + 1x 항생제-항진균제)를 추가합니다.
9. 격일로 신경 성숙 배지로 반중간 변화를 수행합니다.
10. 숙성 단계에서 배지의 색상 변화와 같은 영양 고갈 징후가 있는 경우 오가노이드를 웰당 최대 3mL의 배지를 담을 수 있는 6개의 웰 플레이트로 이동합니다.
11. 선택적으로, EB 형성 후 17일 후에 미세아교세포의 성숙을 촉진하기 위해 6일 동안 사이토카인(IL-34, M-CSF, TGF-β1, CD200, CX3CL1)을 성숙 배지에 보충합니다.
12. 23일째에는 특성화 또는 추가 실험을 위해 생성된 신경 오가노이드를 수집합니다.

4. 3D 신경 오가노이드의 제거 및 면역 염색

1. 4% 파라포름알데히드(PFA) 1mL에 4°C에서 24시간 동안 침지하여 최대 10개의 오가노이드를 고정합니다.
2. 웰당 오가노이드를 96웰의 투명한 바닥 플레이트로 옮기고 200μL의 DPBS로 부드럽게 흔들어 매번 1시간 동안 2회 세척합니다.
3. 오가노이드를 DPBS의 50% 메탄올, 이중 증류수(dd)의 80% 메탄올, 100% 건조 메탄올에 각각 10분씩 4°C에서 부드럽게 흔들어 세척하여 투과시킵니다.
4. 오가노이드를 20% DMSO/메탄올, 80% 메탄올(dd 물), 50% 메탄올(DPBS), 100% DPBS로 연속적으로 세척한 다음 0.2% Triton X-100과 함께 DPBS에서 4°C에서 각각 10분 동안 부드럽게 흔들어 세척합니다. 세탁 후에는 잔류 완충액을 완전히 제거하도록 노력하십시오.
5. 투과화 완충액(0.2% Triton X100, 0.3M 글리신, 20% DMSO가 함유된 DPBS)에서 상온에서 40분 동안 부드럽게 흔든 후 배양합니다.
6. 80rpm의 셰이커에서 부드럽게 흔들면서 37°C에서 1시간 동안 블로킹 버퍼(0.2% Triton X100, 6% 염소 혈청 및 10% DMSO가 함유된 DPBS)를 차단합니다.
7. 항체 희석 완충액(IBA1 1:100, TREM2 1:100, βIII-tubulin, 1:1000, 100 μL/well)의 항체와 함께 37°C에서 2시간 동안 또는 80rpm에서 3일 동안 부드럽게 흔들어 저온실에서 0.2% Tween 20, 100μg/mL 헤파린, 3% 염소 혈청 및 5% DMSO로 DPBS에서 항체와 함께 배양합니다.
8. 0.2% Tween 20, 100μg/mL 헤파린을 5회, 실온에서 각각 10분씩 DPBS로 세척하고 80rpm의 셰이커에서 부드럽게 흔듭니다.
9. 2차 항체(1:200 goat anti-mouse Alexa488)를 37°C에서 1시간 동안 배양한 다음 80rpm의 셰이커에서 부드럽게 흔들면서 밤새 RT합니다.
10. 핵 조영제 염색의 경우 항체 배양과 함께 또는 세척 버퍼에서 DAPI 염색을 수행합니다.
11. 오가노이드를 세척 버퍼에 10회, 37°C에서 10회 10회 세척하고 부드럽게 흔듭니다.
12. 현미경으로 관찰하십시오. 배경이 여전히 높으면 5회 세탁을 계속하십시오.
13. 상등액은 가능한 한 버리십시오. 200μL의 오가노이드 투명화 용액을 추가하고 관찰 전 5분 동안 배양한 후 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지를 촬영합니다.

당사의 프로토콜은 HPC와 iPSC를 구별한 다음 HPC와 iPSC를 혼합하여 EB를 만든 다음 신경 유도, 분화 및 성숙을 수행하는 체계를 따릅니다(그림 1). 높은 품질의 HPC 분화는 EB 형성과 향후 오가노이드 분화의 성공에 매우 중요합니다. 연속 희석 배양 기법을 사용하여 HPC 분화를 시작하기 위해 적절한 수와 크기의 iPSC 콜로니를 생성...

여기에서는 혼합 iPSC 및 iPSC 분화 HPC에서 유래한 EB의 선천성 미세아교세포를 포함하는 3D 신경 오가노이드를 만들기 위한 자세한 프로토콜이 제시됩니다. 대부분의 실험실에서 일반적으로 사용할 수 있는 세포 배양 기술과 장비만 포함하는 비교적 짧고 쉬운 접근 방식입니다.

이 프로토콜의 성공을 위한 가장 중요한 요소는 HPC의 차별화 품질입니다. ?...

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이 연구는 NINDS 교내 연구 기금의 지원을 받습니다.