Получение органоида мозга человека с развитием микроглии

Мы представляем протокол создания органоида человеческого мозга с резидентной микроглией путем включения гемопоэтических клеток-предшественников (HPC), полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), в развитие органоидов.

Трехмерные (3D) культуры органоидов мозга, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), представляют собой важную альтернативу in vitro для изучения развития мозга человека и патогенеза неврологических заболеваний. Тем не менее, отсутствие включения микроглии в органоиды человеческого мозга по-прежнему является основным препятствием для 3D-моделей нейровоспаления. Современные подходы включают либо включение полностью дифференцированной микроглии в зрелые органоиды мозга, либо индукцию микроглиальной дифференцировки на ранней стадии эмбриоидных телец (БЭ), полученных из ИПСК. Первый подход пропускает стадию, когда микроглиальная дифференцировка взаимодействует с соседней нервной средой, а второй подход технически сложен, что приводит к несогласованности между конечными органоидами с точки зрения количества и качества микроглии. Для моделирования органоидов мозга с микроглией для изучения ранних взаимодействий между микроглией и развитием нейронов, высокочистые гемопоэтические клетки-предшественники (HPC), дифференцированные от человеческих iPSC, были включены в полученные из iPSC EB для создания органоидов мозга. Используя иммуноокрашивание и анализ секвенирования РНК одиночных клеток (sc-RNA-seq), мы подтвердили, что HPC были включены в 3D-органоиды, которые в конечном итоге развились в органоиды мозга с микроглией и нейронами. По сравнению с органоидами мозга без HPC, этот подход приводит к значительному включению микроглии в органоиды мозга. Эта новая 3D-модель органоида, которая включает в себя свойства развития микроглии и нервной системы, может быть использована для изучения ранних взаимодействий между врожденным иммунитетом и развитием нервной системы и, возможно, в качестве модели нейровоспаления и нейроинфекционных заболеваний.

Микроглия — это резидентные иммунные клетки в головном мозге, играющие важнейшую роль как в развитии мозга, так и в гомеостазе ^1,2. Активация микроглии приводит к выработке провоспалительных факторов, повышенному фагоцитозу и реактивному окислительному стрессу, который удаляет вторгшиеся патогены и скомпрометированные клетки. Тем не менее, гиперактивация или длительная активация микроглии может, с другой стороны, вызвать нейродегенерацию как механизм патогенеза при многих неврологических расстройствах, ^{включая болезнь} Паркинсона^. Важно, что микроглия включена в соответствующие модели для изучения неврологических расстройств человека. В последние годы стволовые клетки человека использовались для разработки 3D-органоидов в качестве моделей in vitro в качестве альтернативы животным моделям и исследованиям на людях⁵. В идеале человеческие органоиды представляют собой множественные типы клеток и тканевых структур, сходных с соответствующими человеческими органами, которые лучше представляют физиологию и патогенез человека, чем животные модели, но без этических проблем, связанных непосредственно с исследованиями человеческих индивидуумов. Они могут представлять собой будущее моделирования болезней человека для изучения патогенеза и разработки лекарств, а также для руководства индивидуализированной терапией^. Например, 3D-органоиды человеческого мозга, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК), преобладают в области исследований в области нейробиологии, моделируя нейроинфекционные заболевания, включая вирус Зика, SARS-CoV-2⁷, и нейродегенеративные заболевания, включая боковой амиотрофический склероз (БАС) и болезнь Альцгеймера ^8,9. Тем не менее, обычные 3D-нейронные органоиды, использующие двойное ингибирование SMAD для индуцирования дифференцировки нейронов¹⁰, производят органоиды мозга, лишенные микроглии, поскольку они получены от предшественников, рекрутированных из крови, а не из линии нейроэктодермы, из которой нейроны происходят из^11,12. Без наличия микроглии органоиды неадекватны для моделирования инфекций ЦНС, воспаления и связанной с ними нейродегенерации.

Для решения этой важнейшей проблемы были предприняты попытки включить дифференцированную микроглию в органоиды^мозга или индуцировать микроглиальную дифференцировку в органоидах с самого начала, используя альтернативные подходы вместо двойного ингибирования SMAD¹³. Тем не менее, при включении дифференцированной микроглии в органоиды мозга, ранние взаимодействия между развитием нейронов и микроглии упускаются. Это может иметь важное значение для развития ЦНС или патогенеза нейроинфекционных заболеваний, нацеленных на развитие мозга младенцев, таких как вирусная инфекция Зика¹⁴. С другой стороны, дифференцировка врожденной микроглии в органоидах мозга, полученных из ИПСК без прерывистых стадий, включает в себя длительный процесс и имеет более высокую вариабельность в^{конечных продуктах.} В этом протоколе мы включили гемопоэтические клетки-предшественники (HPC), полученные из iPSC, в iPSC для создания эмбриоидных телец (EB), которые в дальнейшем дифференцировались в 3D-органоиды, включающие как нейроны, так и микроглию.

Наш протокол обеспечивает простой подход, который может быть использован для изучения центральной нервной системы человека, включающей ранние нейрон-микроглиальные взаимодействия, а также патогенез нервных инфекционных заболеваний и нейровоспаления с участием активации микроглии.

Исходные образцы крови здоровых взрослых доноров были собраны в Банке крови для трансфузионных препаратов NIH, а подписанные формы информированного согласия были получены в соответствии с Институциональным наблюдательным советом NIH.

1. Получение гемопоэтических клеток-предшественников (ГПК) из ИПСК человека

Примечание: Для получения репрезентативных результатов были использованы клетки 510 и 507 iPSC человека. Методы генерации и поддержания ИПСК можно найти в предыдущей публикации¹⁶.

1. День 0: Покройте 12-луночный клеточный планшет, добавив 500 μл/лунку ледяного раствора Matrigel (матрица базальной мембраны [BMM]), разведенного в среде DMEM/F12, и инкубируйте его в течение не менее 30 минут при комнатной температуре (RT).
2. Полностью удалите надосадочную жидкость покрытия и замените ее 1 мл среды E8 Flex на лунку.
3. Проверьте посев ИПСК в 6-луночном планшете под микроскопом, чтобы убедиться, что ИПСК высокого качества и без признаков дифференцировки. Выберите колонию среднего размера, отметив ее маркером под нижней частью тарелки.
4. Удалите среду из культуры iPSC и добавьте в лунку 500 μл буфера для диссоциации iPSC этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) (0,5 мМ ЭДТА, 0,45 г/л NaCl в DPBS).
5. Наблюдайте под микроскопом за признаками клеточной диссоциации, когда три-четыре ряда клеток от краев колонии начинают сжиматься, а между клетками появляется пустое пространство. Обычно это занимает 1-3 минуты.
6. Полностью откажитесь от раствора ЭДТА. Вытесните отмеченную колонию iPSC путем дозирования 1 мл среды E8 Flex с усилием и непосредственно на нее. Убедитесь, что колония полностью отделяется на клеточные участки, содержащие по 20-50 клеток каждая, после 1-3 пипетирования.
7. Соберите надосадочную жидкость, содержащую клеточные участки, и добавьте ее в первую лунку из покрытых лунок в 12-луночном планшете.
8. Перемешайте лунку с помощью пипетирования один или два раза и перенесите 1 мл клеток во вторую лунку, содержащую 1 мл среды.
9. Повторите шаг 1.8 дважды, чтобы получить серийное разбавление культур iPSC в общей сложности в четырех лунках.
10. Инкубируйте планшет в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO2.
11. Через 24 часа, в день 1, проверьте колонии под микроскопом и подсчитайте количество колоний, непрерывно проходя по всем полям в лунке. Выберите одну лунку, которая содержит 10-20 колоний iPSC.
12. Замените среду на 1 мл среды А из набора для кроветворения. Поставьте тарелку обратно в инкубатор на 48 ч.
13. На 3-й день удалите 500 μл отработанной среды и добавьте 500 μл свежей среды А.
14. На 4-й день понаблюдайте под микроскопом и заметьте значительный рост клеток и дифференцировку от колоний iPSC. Замените среду на 1 мл среды В.
15. Контролируйте дифференцировку клеток под микроскопом и проводите полусредние изменения с помощью 500 мкл среды B через день. HPC-подобные клетки появляются на 6-7 день.
16. На 10-й день наблюдайте под микроскопом яркие одиночные круглые клетки с морфологией нормальных ГПК, плавающие в среде или слабо прикрепленные к единому нижнему слою плоских клеток, с некоторыми рыхлыми клеточными агрегатами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дифференцированные высокопроизводительные вычисления готовы к сбору для определения характеристик или проведения дальнейших экспериментов.
17. Соберите все дифференцированные высокопроизводительные вычисления путем трехкратного пипетирования вверх и вниз с помощью наконечника для дозатора объемом 1 мл, чтобы разбить клеточные агрегаты и отделить высокопроизводительные медицинские вещества от поверхности планшета.
18. Добавьте клетки в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте клетки при давлении 300 x g в течение 5 минут. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл среды В.
19. Подсчитайте клетки и отрегулируйте концентрацию до 1 миллиона клеток/мл. На данном этапе генерируется более 1 млн HPC. При проверке с помощью проточной цитометрии убедитесь, что чистота составляет более 85% клеток с CD34+/CD43+. Убедитесь, что не замечены значительные мертвые клетки (более 5%).

2. Развитие эмбриоидных тел из смешанных ИПСК и ГПК

1. В тот же день сбора HPC убедитесь, что культура iPSC также достигает 80% слияния в одной лунке в 6-луночном планшете (или в двух лунках в 12-луночном планшете).
2. Обработайте одну лунку микролуночного планшета для образования БЭ 500 мкл раствора для промывки, препятствующей прилипанию, добавив его для минимизации образования пузырьков.
3. Вращайте пластину при давлении 2000 x g в течение 5 минут в качающемся роторе ковша, оснащенном держателями пластин, чтобы удалить возможные пузырьки.
4. Полностью удалите промывочный раствор с помощью пипетирования и дважды промойте лунки 1 мл DPBS, а затем 1 мл DMEM/F12 без образования пузырьков.
5. Диссоциируйте иПСК от планшета, обработав клетки 1 мл раствора Аккутазы.
6. Наблюдайте под микроскопом до тех пор, пока клетки не проявят признаки разделения, но все еще не прикрепятся к дну. Обычно это происходит в течение 1-3 минут после лечения Аккутазой. Не переваривайте ИПСК чрезмерно.
7. Раствор Аккутазы удалить полностью, не нарушая клетки, и добавить в лунки 1 мл среды DMEM/F12. Далее диссоциируйте клетки на отдельные клетки, пару раз пипетируя вверх и вниз с помощью наконечника объемом 1 мл.
8. Соберите клетки в пробирку объемом 15 мл и заполните ее до 5 мл средой DMEM/F12. Вращайте ячейки при 300 x g в течение 5 минут.
9. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетирования и ресуспендируйте клетки в 1 мл среды E8 Flex. Подсчитайте количество клеток и отрегулируйте концентрацию клеток до 1 миллиона клеток на мл в среде E8 Flex.
10. Смешайте iPSC с HPC в соотношении 2:1, добавив 1 миллион iPSC (1 мл) и полмиллиона HPC (500 μL) вместе. Добавьте все смешанные клетки в предварительно обработанную лунку микролуночного планшета.
11. Добавьте в надосадочную жидкость 1 мкл стокового раствора ингибитора породы Y27632 (1 мМ) на 1 мл среды. Встряхните пластину из стороны в сторону несколько раз, чтобы равномерно распределить ячейки.
12. Вращайте планшет для микролунок с температурой 300 x g в течение 5 минут в качающемся роторе ковша, оснащенном держателями планшетов. Понаблюдайте под микроскопом, чтобы увидеть, осели ли клетки в микролунках. (Дополнительный рисунок 1А).
13. Не тревожа клетки, поместите планшет в инкубатор с 5% содержанием_CO2 при температуре 37 °C.
14. На 2-й день, через 48 часов, наблюдайте за клетками под микроскопом на предмет образования БЭ. Когда EB четко сформированы, переходите к следующему шагу (дополнительный рисунок 1B).
15. Обработайте 24-луночный планшет для клеточных культур промывочным буфером, препятствующим адгезии (500 μл) в течение 15 минут, чтобы получить пластину с низким уровнем прикрепления.
16. Полностью снимите промывочный буфер и дважды промойте лунки 1 мл DPBS, затем добавьте в лунки 1 мл среды E8 Flex.
17. Ресуспендируйте БЭ в планшете для микролунок для культивирования, несколько раз наложив на них наконечник для пипетки с отверстием объемом 1 мл.
18. Для каждой лунки с низкой адгезией обрабатывают 24 луночные планшеты, собирают и добавляют 100 мкл среды, содержащей БЭ. В результате получится 10-20 ЭБ на скважину. Добавьте среду E8 Flex в старую лунку, содержащую оставшиеся EB в качестве резерва.
19. Инкубируйте планшет в клеточном инкубаторе с температурой 37 °C и 5%_CO2 в течение 48 часов.

3. 3D индукции, пролиферации и созревания нервных органоидов

1. На 2-й день после образования БЭ разморозьте аликвоты ВММ на льду не менее 30 минут.
2. Используйте предварительно охлажденный наконечник объемом 20 мкл и добавьте 15 мкл ледяной капли BMM поверх среды, чтобы покрыть EB. В результате получается пленка из BMM, к которой будут прикрепляться и расти EB.
3. Поместите планшет в клеточный инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO₂ .
4. На 4-й день, после образования EB, осторожно удалите 500 μL среды, не отбрасывая EB, и повторите нанесение BMM-покрытия, следуя шагу 3.2.
5. Немедленно начните нейронную индукцию, добавив 500 мкл среды для нейронной индукции PSC поверх клеток.
6. На 6 и 8 день проведите половинную замену среды, осторожно удалив 500 мкл среды, не касаясь клеток, и добавив 500 мкл нейроиндукционной среды.
7. На 10, 12 и 14 дни проведите половинное изменение среды с помощью нейростволовых клеток (НСК): Knockout DMEM/F12 + 1x добавка Glutamax + 1x Neural supplement + bFGF + EGF.
8. На 15-й день переложите всю лунку сфер со средой на новую 12-луночную пластину, обработанную раствором для промывки, препятствующей адгезии, как описано ранее. Добавьте 500 мкл среды для созревания нейронов (DMEM/F12 + 1x добавка N2 + 1x добавка B27 + 1x антибиотики-антимикотики) поверх культуры.
9. Проводите полу-средние изменения со средой созревания нейронов через день.
10. На стадии созревания, если есть признаки истощения питательных веществ, такие как изменение цвета среды, переместите органоид в 6 луночных пластин, которые вмещают до 3 мл среды на лунку.
11. По желанию, через 17 дней после формирования БЭ следует дополнить среду созревания цитокинами (IL-34, M-CSF, TGF-β1, CD200, CX3CL1) в течение 6 дней для облегчения созревания микроглии.
12. На 23-й день соберите полученные нейронные органоиды для определения характеристик или дальнейших экспериментов.

4. Клиренс и иммуноокрашивание 3D нейроорганоидов

1. Фиксируют до 10 органоидов путем погружения в 1 мл 4% параформальдегида (PFA) при 4 °C на 24 ч.
2. Переложите органоиды на лунку в 96-луночную чистую донную пластину и промойте 200 мкл DPBS 2 раза в течение 1 часа каждый раз с легким встряхиванием.
3. Пермеабилизируйте органоиды, промыв их один раз в 50% метанола в DPBS, 80% метанола в воде двойной дистилляции (dd) и 100% сухого метанола в течение 10 мин каждый, при 4 °C с легким встряхиванием.
4. Промыть органоиды последовательно в 20% ДМСО/метаноле, 80% метаноле в воде dd, 50% метаноле в DPBS, в 100% DPBS, затем в DPBS с 0,2% Triton X-100, в течение 10 мин каждый при 4 °C с легким встряхиванием. Приложите усилия, чтобы полностью удалить остаточный буфер после каждой стирки.
5. Инкубировать в проникающем буфере (DPBS с 0,2% Triton X100, 0,3% М глицина и 20% DMSO) с легким встряхиванием в течение 40 минут при RT.
6. Блокируйте в блокирующем буфере (DPBS с 0,2% Triton X100, 6% козьей сывороткой и 10% DMSO) в течение 1 ч при 37 °C с легким встряхиванием на шейкере при 80 об/мин.
7. Инкубируют с антителами в буфере для разведения антител (IBA1 1:100, TREM2 1:100, βIII-тубулин, 1:1000, 100 μL /лунка в DPBS с 0,2% Tween 20, 100 мкг/мл гепарина, 3% козьей сыворотки и 5% ДМСО) при 37 °C в течение 2 ч или в холодном помещении с легким встряхиванием при 80 об/мин в течение 3 дней.
8. Умываться с DPBS 0,2% Tween 20, 100 мкг/мл Гепарина 5 раз, по 10 мин каждый в RT с легким встряхиванием на шейкере при 80 об/мин.
9. Инкубировать с вторичными антителами (1:200 козьего антимышиного Alexa488) при 37 °C в течение 1 ч с последующей ЛТ в течение ночи с легким встряхиванием в шейкере при 80 об/мин.
10. Для ядерного контрастного окрашивания выполняйте окрашивание DAPI вместе с инкубацией антител или в промывном буфере.
11. Промойте органоиды 10 раз в промывочном буфере, каждый раз по 10 мин при температуре 37 °C, осторожно встряхивая.
12. Наблюдайте под микроскопом. Если фон все еще высокий, продолжайте мыть его 5 раз.
13. Выбросьте надосадочную жидкость как можно больше. Добавьте 200 мкл раствора для очистки органоидов и инкубируйте его в течение 5 мин перед наблюдением и сделайте снимки с помощью конфокального микроскопа.

Наш протокол следует схеме дифференциации HPC от iPSCs и последующего смешивания HPC с iPSC для получения EB с последующей нейронной индукцией, дифференцировкой и созреванием (рис. 1). Высокое качество дифференцировки HPC имеет решающее значен?...

Здесь представлен подробный протокол создания 3D нейронных органоидов, содержащих врожденную микроглию, из БЭ, полученных из смешанных ИПСК и ИПСК-дифференцированных ГПК. Это относительно короткий и простой подход, включающий только методы и оборудование для клеточн...

Авторам нечего раскрывать.

Это исследование проводится при поддержке фондов внутренних исследований NINDS.