Rahim dinamiğinin korunması ve transplantasyonunu incelemek için bir domuz modeli oluşturulması

Cerrahi tedarikten makine perfüzyonunun başlatılmasına kadar ayrıntılı ve tekrarlanabilir bir domuz uterus modeli tarif edilmekte ve transplantasyonda uterusun korunmasının incelenmesine olanak sağlanmaktadır.

Bugüne kadar, rahim nakli, Rokitansky sendromlu olanlar gibi mutlak uterus infertilitesi olan kadınların hamilelik yaşaması ve doğum yapması için tek seçenektir. Son yıllarda uterus transplantasyonuna olan ilginin artmasına rağmen, iskemi-reperfüzyon hasarı ve greft kalitesi ve rejeksiyonu üzerindeki etkisi de dahil olmak üzere birçok konu hala daha fazla araştırma gerektirmektedir. Son literatürde uterus transplantasyonu sonrası trombotik komplikasyon oranının %20'lere kadar çıktığı vurgulanmıştır. Bu tip bir komplikasyon, hipoksiye bağlı endotel hücre hasarından kaynaklanabilir ve sıklıkla uterus greft reddine yol açar. Hipoksi, katı organ transplantasyonunda greft koruması için altın standart olmaya devam eden statik soğuk depolama sırasında indüklenir. Son zamanlarda, makine perfüzyonu kullanılarak yapılan dinamik korumanın, iskemik ve hipoksik hasarı azaltarak konvansiyonel ve marjinal organların uzun süreli depolanmasını iyileştirdiği gösterilmiştir. Bu protokolde, makine perfüzyon protokolünün bağlantısını ve başlatılmasını sağlamak için her iki uterus pedikülüne dayalı olarak domuz uterusu temini ve dinamik koruma ile ilgili her cerrahi adımı tanımlamayı amaçlıyoruz.

Rahim nakli (UTx) son on yılda önemli ölçüde gelişmiştir ve birkaç ekip klinik araştırma programlarına başlamıştır. Bugüne kadar, UTx'in ana endikasyonu, Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser (MRKH) sendromu da dahil olmak üzere uterus agenezisi nedeniyle mutlak uterus infertilitesidir. MRKH sendromu, 5.000 kadın canlı doğumda bir prevalansı olan konjenital bir hastalıktır¹. UTx, malign hastalık, doğum sonrası kanama, uterus fibroidleri, enfeksiyöz sekeller ve çeşitli konjenital malformasyonlara bağlı histerektomiden kaynaklananlar da dahil olmak üzere ek kısırlık nedenlerini potansiyel olarak ele alabilir. Bu, 500 kadından yaklaşık 1'inin UTx için uygun olabileceğini düşündürmektedir.

İlk klinik UTx 2000 yılında Suudi Arabistan'da meydana geldi², ancak vasküler komplikasyonlar üç ay sonra histerektomiye yol açtı. O zamandan beri, hem yaşayan hem de ölen donörlere dayalı olarak birkaç UTx vakası gerçekleştirildi^ve bu da 80'den fazla canlı doğumla sonuçlandı ^3,4. Solid organ transplantasyonu ve vaskülarize kompozit allotransplantlar (VCA) alanına benzer şekilde, immün rejeksiyon UTx'te önemli bir zorluktur. ⁵ Mikrodolaşım yetmezliği ve venöz staz dahil olmak üzere çeşitli faktörler greft reddine yol açabilir ve her ikisi de trombotik komplikasyona yol açabilir. Transplantasyonda uterus vaskülarizasyonunu inceleyen yakın tarihli bir derlemede, Kristek ve ark. %15'e kadar arteriyel tromboz ve %5'e kadar venöz tromboz bildirmiştir⁶. Ek olarak, iskemi-reperfüzyon hasarı (IRI) greft disfonksiyonuna ve akut rejeksiyona yol açabileceğinden, soğuk ve sıcak iskemi başarılı bir transplantasyon için ele alınması gereken kritik faktörlerdir ^7,8. Miyositler, 6 saat^9'a kadar laktat üreterek iskemik strese yanıt verir, bundan sonra kas hücresi hasarı geri döndürülemez. Soğuk iskeminin myometrium üzerindeki etkisi klinik çalışmalarda belgelenmiştir ve statik soğuk depolama (SCS) sırasında hücre içi benzeri Wisconsin Üniversitesi solüsyonunun kullanımının, prostaglandine daha iyi kasılma yanıtı ve Ringer'in asetat çözeltisi¹⁰ ile karşılaştırıldığında daha yüksek ATP konsantrasyonları ile korumayı iyileştirdiği gösterilmiştir. Bununla birlikte, sıcak ve soğuk iskeminin etkisi UTx'te yeterince araştırılmamıştır.

SCS, uterus da dahil olmak üzere VCA'nın korunması ve çoğu katı organ nakli için altın standart olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, son yıllarda, makine perfüzyon sistemleri ve koruma çözümlerindeki önemli gelişmeler bir paradigma değişikliğine yol açmıştır. Dinamik makine perfüzyonunun sağlıklı ve marjinal katı organların korunmasını iyileştirebileceğini ve uzatabileceğini destekleyen güçlü kanıtlar bulunmaktadır 11,12,13,14,15. Bu teknik şu anda klinik uygulamada akciğer, kalp, karaciğer ve böbrek nakli için yaygın olarak kullanılmaktadır 14,16,17,18. Dinamik organ koruması, sürekli oksijen ve besin kaynağı sağlayarak soğuk iskemi ve hipoksi yaralanmalarını en aza indirmek, toksik metabolitleri temizlemek ve greft kalitesi ve canlılık parametrelerini iyileştirmek dahil olmak üzere birçok fayda göstermiştir^12,19. Hipotermikten normotermik makine perfüzyonuna (oksijen taşıyıcılı veya taşıyıcısız) kadar çeşitli modaliteler geliştirilmiştir, birkaç perfüzat mevcuttur, ancak sadece birkaçı uterus²⁰ üzerinde test edilmiştir. Bu tür araştırma perspektiflerinin önemli katkısını sağlamak için, ilgili klinik öncesi cerrahi modeller çok önemlidir.

Bu çalışmada, subnormotermik makine perfüzyonu (SNMP), oda sıcaklığında (yaklaşık 20 °C) bir perfüzatın bir silindir pompası ve bir oksijenatör aracılığıyla dolaştırılmasıyla oksijenli dinamik organ koruma yöntemi olarak kullanılmıştır. Anatomi, fizyoloji ve damar büyüklüğü açısından insan üreme sistemi ile benzerlikleri nedeniyle UTx ve koruma ile ilgili çalışmalarla ilgili bir domuz modeli kullanılmaktadır^21,22. Rahim, dolaşım ölümünü takiben temin edilir, bu da kardiyak ölümden sonra bağış için uygunluk sağlar ve diğer tüm ilgili katı organlardan sonra bir tedarik gecikmesi olasılığını düşündürür ^23,24. Ek olarak, bu model, "3R" ilkelerini uygulayarak, diğer organlara odaklanan yerleşik nakil laboratuvarlarında rahim koruma çalışmalarının geliştirilmesini kolaylaştırır²⁵. Amaç, uterus pediküllerine dayalı yeni bir koruma modeli oluşturmak ve dinamik koruma için güvenilirliğini değerlendirmektir. Histerektomiden korumaya kadar tüm prosedür adımları detaylandırılmıştır ve SNMP kullanımıyla ilgili vurgulanan kilit noktaları kapsar.

Aşağıda açıklanan protokol, her iki uterin arter için tek bir pompa ve bir "Y-tubing" giriş sistemine dayanan bir ön deneyden önce geldi (Ek Şekil 1). 4 h-SNMP'den sonra, organ başlangıçtaki ağırlığının% 50'sinden fazlasını kazandı. Akış, basınç, direnç ve ağırlık değişimi Ek Şekil 2'de gösterilmiştir. İki girişe ayrılmış tek bir perfüzyon sistemi, her bir akış hızının her iki tarafın basıncına modülasyonuna izin vermedi. Bu durumda, SNMP organın yarısında önemli miktarda ödeme yol açmıştır (Ek Şekil 3). Bu sistemin rahim modeli için uygun olmadığı kanıtlandı, çünkü kısmen mükemmel simetrik bir model olarak düşünülmemesi gerekiyordu. Bu nedenle, bu protokolde her uterin arter için bir tane olmak üzere iki makine perfüzyon sistemi kullanıldı.

Tüm hayvanlar, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüsü Rehberi'ne uygun olarak insancıl bakım aldı ve protokoller Massachusetts Genel Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Genel olarak, uterus alımı için 30-40 kg ağırlığında 6 dişi Yucatan minipigi kullanıldı ve dört uterusa SNMP uygulandı. Tüm hayvanlar ötenazi öncesi bir tam doz (100 IU / kg) ile heparinize edildi. Organ alımı, 60 dakikadan daha az sıcak iskemi ile ölüm sonrası gerçekleşti. "3R" ilkelerine göre farklı çalışmalar için aynı donörden başka organlar da toplanmış olabilir²⁵. Protokolde kullanılan tüm reaktifler ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Ameliyat öncesi hazırlık (ameliyattan bir gün önce)

1. Perfüzat çözeltisini hazırlayın. Subnormotermik makine perfüzyonu için VCA için optimize edilmiş bir Steen+ solüsyonu kullanıldı^26,27. Rahim başına bir litre çözelti kullanıldı ve bileşim Tablo 1'de detaylandırılmıştır.
   NOT: Yaklaşık 7.5-7.6'lık bir pH elde etmek amacıyla perfüzata büyük miktarda sodyum hidroksit eklenir. Bu değer açıkça yüksektir, ancak makine bir karbojen karışımı (%95 oksijen; %5 karbon dioksit) ile sirküle edilirken ve oksijenlendirilirken pH düşme eğiliminde olacağından gereklidir.
2. Makine perfüzyon sistemini kurun (Şekil 1). Perfüzat sirküle edildiğinde sızıntı ve kabarcık olup olmadığını kontrol edin.

2. Ölüm sonrası rahim temini

NOT: Kardiyak ölüm ve/veya ölüm sonrası tedarikten sonra bağışı simüle etmek için, hayvana yerel IACUC yönergelerine göre ötenazi yapılmalıdır. Çalışmaya müdahale edebilecek toksisiteyi önlemek için intravenöz Pentobarbital enjeksiyona kan durumu tercih edilmelidir.

1. Ötenazi yapılmış hayvanı sırtüstü pozisyona getirin. Karın bölgesini fırçalayın ve steril örtüler yerleştirin.
2. #20 bıçakla 10 cm'lik medyan göbek altı insizyon yapın.
3. Deri altı dokusunu ve aponevrozu monopolar elektrikli bir neşter ile açın.
   NOT: Karın boşluğunun açılarak bağırsaklara zarar vermemesine dikkat edilmelidir.
4. İnce bağırsağı cerrahi bir gazlı bezle bir kenara koyun ve uterusu açığa çıkarın.
   NOT: Kullanılan modelin rahim anatomisi Şekil 2A'da gösterilmiştir.
5. Sol ve sağ taraflar için benzer şekilde aşağıdaki gibi devam edin:
   1. Rahim damarlarını tanımlayın.
      NOT: Uterin ven, uterin artere lateral olarak konumlandırılmıştır (Şekil 3).
   2. Dik açılı forseps ile uterus venine lateral olarak geniş ligament içine bir açıklık oluşturun.
   3. Bu açıklıktan 2-0 ipek kravat dikişleri yerleştirin ve yumurtalık damarlarını bağlayın ve koter kullanarak uterusu geniş ligamentteki çevre bağ dokusundan serbest bırakın.
   4. Rahim-yumurtalık damarlarını 2-0 ipek bağ dikişleri ile bağlayın ve yumurtalığı ve tüpü çıkarın.
   5. Rahim damarlarını iskeletleştirin ve mümkün olduğunca iç iliak damarlara yakın bölün.
      NOT: Kanülasyonu kolaylaştırmak ve pedikül koptuktan sonra pedikülün geri çekilmesini tahmin etmek için pedikülün mümkün olduğu kadar uzun süre tutulmasına dikkat edilmelidir.
   6. Karşı taraftaki 2.5.1-2.5.5 adımlarını tekrarlayın.
6. Monopolar elektrikli neşter ile rahim ağzını keserek uterusu çıkarın.
   NOT: Uygun serviks damarı pıhtılaşmasını sağlamak için uzun bir temas süresi kullanın ve perfüzyon sırasında sızıntıyı önleyin.

3. Perfüzyon için hazırlık

1. Bir yan masada, mikrocerrahi bir dilatör kullanarak her iki uterin arteri genişletin ve bir anjiyokateter yerleştirin. Kanülasyonu 3-0 ipek bağlarla sabitleyin (Şekil 2B).
   NOT: Burada tüm arterler için 18 G anjiyokateter kullanıldı. Bifurkasyon nispeten yakın olduğundan, seçici kanülasyondan kaçınmak için kateteri çok uzağa yerleştirmemeye özen gösterilmelidir. Rahim damarları kanüle edilmez, çünkü venöz çıkış bu damarların lümenini açık tutmak için yeterlidir ve kolay toplanmaya izin verir. Zaman tasarrufuna ek olarak, travmatik kanülasyon vasküler hasara yol açabilir ve potansiyel olarak venöz akışı etkileyebilir.
2. Her iki uterin arteri, tüm damarlar yıkanana ve çıkışlar netleşene kadar her iki tarafta 20 mL heparin solüsyonu ile yavaşça manuel olarak yıkayın.
   NOT: Mikrovasküler yaralanmalara ve perfüzyon yetmezliğine yol açabilecek yüksek basınçla yıkama yapılmamasına dikkat edilmelidir.
3. Rahmi tartın.

4. Subnormotermik makine perfüzyonu

NOT: Rahim için iki bağımsız makine perfüzyon sistemi gereklidir. Her uterin arter, bir silindir pompası, bir oksijenatör, bir baloncuk tutucu ve bir basınç sensöründen oluşan bir perfüzyon sistemine bağlanır. Bir rezervuardaki perfüzat, uterus arteri yoluyla organdan her iki taraftaki uterus damarına geçmeden önce yukarıda listelenen elemanlara bağlı silikon tüpler aracılığıyla dolaşır, burada perfüzat çıkar ve aynı rezervuarda serbest bırakılır.

1. Uterin arter kanüllerini giriş tüpüne bağlayarak uterusu makine perfüzyon sistemlerine bağlayın (Şekil 1).
2. Makaralı pompayı kullanarak, 25-35 mmHg arasında sabit bir arteriyel basıncı korumak için akış hızını düşük (2,5-4,0 mL/dak) olarak ayarlayın.
3. 1 mL'lik bir şırınga kullanarak hem giriş hem de çıkışta önceden tanımlanmış her bir zaman noktasında canlılık parametrelerini değerlendirin ve numuneleri kan gazı sistemi makinesiyle analiz edin [örneğin, kan gazı ölçümleri (pH, pCO₂, pO₂, laktat, baz fazlalığı, bikarbonat), glikoz, sodyum, potasyum, kalsiyum, klorür].
   NOT: Bu protokolde perfüzyon 4 saat sürer ve her 30 dakikada bir giriş ve çıkıştan örnekler alınır.
4. Perfüzyonun sonunda uterusu tartın.

Perfüzyon sırasında sistem, deney sırasında basıncı kaydeden bir basınç sensörüne bağlandı. Basınç başlangıçta uterussuz bir sistem için kaydedildi ve gerçek organ basıncını elde etmek için uterus perfüzyonu sırasında basınç kayıtlarından çıkarıldı. Akış hızı, basıncı istenen aralıkta tutacak şekilde uyarlandı ve silindir pompası tarafından kontrol edildi. Direnç, R = P / Q (R: direnç (mmHg.mL.min-1); P: basınç (mmHg); Q: akı?...

Genellikle VCA'nın bir parçası olarak kabul edilen uterus nakli, son birkaç yılda hızla gelişmiştir. Buna paralel olarak, katı organ korumasını iyileştirmede sağlam kanıtlar gösterdiği için VCA'da makine perfüzyonu araştırılmaya başlandı. Hipotermik ve subnormotermik makine perfüzyonu, miyokutanöz ve kemik içeren VCA^26,27,28'in domuz modellerinde 24 saate kadar korumaya...

Tüm yazarların beyan edecek herhangi bir mali çıkarı yoktur.

Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından R01AR082825 No'lu (BEU) ve Shriners Children's 84308 (YB) ödülü altında finanse edilmiştir. HO ve YB, Fondation des Gueules Cassées'den fon aldı. Société Française de Chirurgie Plastique, Reconstructrice et Esthétique (SOFCPRE, Fransa) ve CHU de Rennes'den (Fransa) YB'ye verilen destek büyük ölçüde kabul görmektedir.