建立猪模型研究子宫动态保存和移植

描述了一种详细且可重复的猪子宫模型，从手术采购到机器灌注的开始，允许研究移植中的子宫保存。

迄今为止，子宫移植是绝对子宫不孕症女性（例如患有 Rokitansky 综合征的女性）怀孕和分娩的唯一选择。尽管近年来人们对子宫移植的兴趣日益浓厚，但仍有几个问题需要进一步研究，包括缺血再灌注损伤及其对移植物质量和排斥反应的影响。最近的文献强调子宫移植后血栓并发症的发生率高达 20%。这种类型的并发症可能是由缺氧诱导的内皮细胞损伤引起的，通常会导致子宫移植物排斥反应。在静态冷藏期间诱导缺氧，这仍然是实体器官移植中移植物保存的金标准。最近，使用机器灌注的动态保存已被证明可以通过减少缺血和缺氧损伤来改善常规和边缘器官的长期储存。在该协议中，我们旨在描述基于双子宫蒂的猪子宫获取和动态保存所涉及的每个手术步骤，以实现机器灌注协议的连接和启动。

子宫移植 （UTx） 在过去十年中取得了长足的发展，几个团队开始了临床研究项目。迄今为止，UTx 的主要适应症是由于子宫发育不全引起的绝对子宫不孕症，包括 Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser （MRKH） 综合征。MRKH 综合征是一种先天性疾病，患病率为 1/5,000 名活产女性¹。UTx 可能会解决不孕症的其他原因，包括因恶性疾病、产后出血、子宫肌瘤、感染性后遗症和各种先天性畸形而导致的子宫切除术引起的不孕症。这表明大约每 500 名女性中就有 1 名可能有资格接受 UTx。

有史以来第一次临床 UTx 于 2000 年在沙特阿拉伯发生²，但血管并发症导致三个月后进行了子宫切除术。从那时起，已经根据在世和已故供体进行了几例 UTx 病例，导致 80 多名活产婴儿 ^3,4。与实体器官移植和血管化复合同种异体移植 （VCA） 领域类似，免疫排斥反应是 UTx 的一个重大挑战。⁵ 有几个因素会导致移植物排斥反应，包括微循环衰竭和静脉淤滞，这两者都可能导致血栓形成并发症。在最近一项研究移植中子宫血管形成的综述中，Kristek 等人报告了高达 15% 的动脉血栓形成和 5% 的静脉血栓形成⁶。此外，冷缺血和热缺血是成功移植必须解决的关键因素，因为缺血再灌注损伤 （IRI） 可导致移植物功能障碍和急性排斥反应 ^7,8。肌细胞通过产生乳酸长达 6 小时⁹ 来响应缺血应激，之后肌肉细胞损伤是不可逆的。临床研究已证明冷缺血对子宫肌层的影响，与醋酸林格氏液相比，在静态冷藏 （SCS） 期间使用细胞内样威斯康星大学溶液已被证明可以改善保存，对前列腺素的收缩反应更好，ATP 浓度更高¹⁰。然而，在 UTx 中，热缺血和冷缺血的影响仍然没有得到充分探讨。

SCS 仍然是 VCA 保存（包括子宫）和大多数实体器官移植的金标准。然而，近年来，机器灌注系统和保存解决方案的重大进步导致了范式的转变。现在有强有力的证据表明，动态机器灌注可以改善和延长健康和边缘实体器官的保存 11,12,13,14,15。该技术现在常用于肺、心脏、肝脏和肾脏移植的临床实践 14,16,17,18。动态器官保存显示出多种益处，包括通过提供持续的氧气和营养供应、清除有毒代谢物以及提高移植物质量和活力参数来最大限度地减少冷缺血和缺氧损伤^12,19。已经开发了多种方式，从低温到常温机器灌注（有或没有氧气载体），有几种灌注液可用，但只有少数几种在子宫²⁰ 上进行了测试。为了确保此类研究观点的实质性贡献，相关的临床前手术模型至关重要。

在这项工作中，通过滚轮泵和氧合器循环灌注液，在室温 （约 20 °C） 下将亚常温机器灌注 （SNMP） 用作含氧动态器官保存方法。由于猪模型在解剖学、生理学和血管大小方面与人类生殖系统相似，因此采用了与 UTx 和保存研究相关的猪模型^21,22。子宫是在循环性死亡后获得的，为心源性死亡后的捐赠提供了相关性，并表明在所有其他相关实体器官之后可能会延迟采购^23,24。此外，该模型还促进了在已建立的移植实验室内开展子宫保存研究，重点关注其他器官，应用“3R”原则²⁵。目的是建立一种基于子宫蒂的新保存模型，并评估其动态保存的可靠性。从子宫切除术到保存，所有程序步骤都很详细，包括使用 SNMP 的突出关键点。

下面描述的方案在基于单个泵和两个子宫动脉的“Y 管”流入系统的初步实验之前（补充图 1）。4 h-SNMP 后，器官增加了其初始重量的 50% 以上。流量、压力、阻力和重量变化如 补充图 2 所示。分成两个入口的单个灌注系统不允许根据每一侧的压力调节每个流速。在这种情况下，SNMP 导致器官的一半严重水肿（补充 图3）。事实证明，该系统不适合子宫模型，部分原因是它不应被视为完全对称的模型。因此，该方案使用了两种机器灌注系统，每个子宫动脉一种。

所有动物都按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南接受了人道护理，并且这些协议得到了马萨诸塞州总医院机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。总体而言，6 只体重为 30-40 公斤的雌性尤卡坦迷你猪用于子宫采购，其中 4 只子宫接受了 SNMP。在安乐死前，所有动物均用一剂全剂量 （100 IU/kg） 肝素化。器官获取发生在死后，热缺血时间少于 60 分钟。根据“3R”原则，可以从同一个供体那里采集其他器官用于不同的研究²⁵。有关实验步骤中使用的所有试剂和设备的详细信息，请参阅 材料表 。

1. 术前准备（手术前一天）

1. 准备灌注液。对于次正常机器灌注，使用了针对 VCA 优化的 Steen+ 解决方案^26,27。每个子宫使用 1 升溶液，成分详见表 1。
   注：在灌注液中加入大量氢氧化钠，以达到 7.5-7.6 左右的 pH 值。这个值显然很高，但也是必要的，因为当机器循环并与碳素混合物（95% 氧气;5% 二氧化碳）充氧时，pH 值往往会下降。
2. 设置机器灌注系统（图 1）。检查灌注液循环时是否有泄漏和气泡。

2. 死后子宫采购

注意：为了模拟心源性死亡和/或死后采购后的捐赠，应根据当地的 IACUC 指南对动物实施安乐死。放血应优于静脉注射戊巴比妥，以避免可能干扰研究的毒性。

1. 将安乐死的动物置于仰卧位。擦洗腹部并放置无菌窗帘。
2. 用 #10 刀片做一个 20 cm 的中间脐下切口。
3. 用单极电动手术刀打开皮下组织和腱膜。
   注意：必须注意不要因打开腹腔而损坏肠道。
4. 用手术纱布将小肠放在一边，露出子宫。
   注意：所用模型的子宫解剖结构如图 2A 所示。
5. 对左侧和右侧执行类似的作，如下所示：
   1. 识别子宫血管。
      注意：子宫静脉位于子宫动脉的外侧（图 3）。
   2. 用直角镊子在子宫静脉外侧的阔韧带上开一个口。
   3. 通过这个开口，插入 2-0 丝带缝合线以结扎卵巢血管并使用烧灼术从宽韧带中的周围结缔组织中释放子宫。
   4. 用 2-0 丝带缝合线结扎子宫-卵巢血管，并去除卵巢和输卵管。
   5. 将子宫血管骨架化，并尽可能靠近髂内血管进行分离。
      注意：必须注意尽可能长时间地保持椎弓根，以促进插管并预测椎弓根被切断后椎弓根回缩。
   6. 在另一侧重复步骤 2.5.1-2.5.5。
6. 用单极电动手术刀切开子宫颈，切除子宫。
   注意：使用较长的接触时间以确保宫颈血管正常凝固，防止灌注过程中渗漏。

3. 灌注准备

1. 在边桌上，使用显微外科扩张器扩张双侧子宫动脉并插入血管导管。用 3-0 丝带固定插管（图 2B）。
   注意：在这里，所有动脉都使用了 18 G 血管导管。必须注意不要将导管插入太远，以避免选择性插管，因为分叉处相对较近。子宫静脉没有插管，因为静脉流出足以保持这些血管的管腔开放，便于收集。除了节省时间外，创伤性插管还可能导致血管损伤并可能影响静脉流动。
2. 每侧用 20 mL 肝素溶液缓慢手动冲洗双侧子宫动脉，直到所有血管都被冲走并且流出物清晰。
   注意：必须注意不要用高压冲洗，这可能导致微血管损伤和灌注失败。
3. 称量子宫。

4. 次正常机器灌注

注意：对于子宫，需要两个独立的机器灌注系统。每个子宫动脉都连接到一个灌注系统，该系统由滚轮泵、氧合器、气泡阱和压力传感器组成。储液槽中的灌注液通过与上述元件相连的硅胶管循环，然后通过子宫动脉流经器官到达两侧的子宫静脉，灌注液在同一个储液器中流出并释放。

1. 通过将子宫动脉插管连接到流入管中，将子宫连接到机器灌注系统（图 1）。
2. 使用滚轮泵，将流速调节至低 （2.5-4.0 mL/min），以保持 25-35 mmHg 之间的恒定动脉压。
3. 使用 1 mL 注射器评估流入和流出的每个预定义时间点的活力参数，并使用血气系统机器分析样品 [例如，血气指标（pH、pCO₂、pO₂、乳酸、碱过量、碳酸氢盐）、葡萄糖、钠、钾、钙、氯化物]。
   注意：在该方案中，灌注持续 4 小时，每 30 分钟采集一次来自流入和流出的样品。
4. 在灌注结束时称量子宫。

在灌注过程中，系统连接到一个压力传感器，该传感器在实验过程中记录压力。最初记录的是无子宫系统的压力，从子宫灌注期间的压力记录中减去压力以获得真实的器官压力。调整流速以将压力保持在所需范围内，并由滚轮泵控制。使用公式 R = P / Q 计算电阻 （R： 电阻 （mmHg.mL.min-1）;P： 压力 （mmHg）;Q：流速 （mL/min））。

灌注参数的演?...

子宫移植通常被认为是 VCA 的一部分，在过去几年中得到了迅速发展。同时，开始在 VCA 中探索机器灌注，因为它在改善实体器官保存方面显示出强有力的证据。低温和亚恒温机器灌注允许在肌皮和含骨的 VCA 的猪模型中保存长达 24 小时 26,27,28。由于子宫面临的挑战与含骨骼和皮肤的 VCA 相当，因此探?...

所有作者都没有需要申报的经济利益。

这项工作由美国国立卫生研究院 （National Institute of Health） 第 R01AR082825 号 （BEU） 和 Shriners Children's 84308 （YB） 部分资助。HO 和 YB 获得了 Fondation des Gueules Cassées 的资助。非常感谢 Société Française de Chirurgie Plastique、Reconstructrice et Esthétique（法国 SOFCPRE）和 CHU de Rennes（法国）对 YB 的支持。