Establecimiento de un modelo porcino para estudiar la preservación dinámica del útero y el trasplante

Se describe un modelo detallado y reproducible de útero porcino, desde la obtención quirúrgica hasta el inicio de la perfusión mecánica, lo que permite el estudio de la preservación del útero en el trasplante.

Hasta la fecha, el trasplante de útero es la única opción para que las mujeres con infertilidad uterina absoluta, como las que tienen síndrome de Rokitansky, experimenten el embarazo y den a luz. A pesar del creciente interés en el trasplante de útero en los últimos años, hay varios temas que aún requieren más investigación, incluida la lesión por isquemia-reperfusión y su impacto en la calidad y el rechazo del injerto. La literatura reciente ha puesto de manifiesto una tasa de complicaciones trombóticas de hasta el 20% tras el trasplante de útero. Este tipo de complicación puede ser el resultado del daño de las células endoteliales inducido por la hipoxia, que a menudo conduce al rechazo del injerto uterino. La hipoxia se induce durante el almacenamiento estático en frío, que sigue siendo el estándar de oro para la preservación del injerto en el trasplante de órganos sólidos. Recientemente, se ha demostrado que la preservación dinámica mediante perfusión mecánica mejora el almacenamiento a largo plazo de órganos convencionales y marginales al reducir la lesión isquémica e hipóxica. En este protocolo, nuestro objetivo es describir todas las etapas quirúrgicas involucradas en la obtención y preservación dinámica del útero porcino, a partir de ambos pedículos uterinos, para permitir la conexión e inicio del protocolo de perfusión con máquina.

El trasplante de útero (UTx) se ha desarrollado significativamente en los últimos diez años, con varios equipos iniciando programas de investigación clínica. Hasta la fecha, la principal indicación de UTx es la infertilidad uterina absoluta debida a agenesia uterina, incluido el síndrome de Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser (MRKH). El síndrome MRKH es un trastorno congénito con una prevalencia de uno de cada 5.000 nacidos vivos femeninos¹. UTx podría abordar potencialmente causas adicionales de infertilidad, incluidas las resultantes de la histerectomía debido a una enfermedad maligna, hemorragia posparto, fibromas uterinos, secuelas infecciosas y diversas malformaciones congénitas. Esto sugiere que aproximadamente 1 de cada 500 mujeres puede ser elegible para UTx.

El primer UTx clínico ocurrió en el año 2000 en Arabia Saudita², pero las complicaciones vasculares llevaron a una histerectomía tres meses después. Desde entonces, se han realizado varios casos de UTx, tanto en donantes vivos como fallecidos, resultando en más de 80 nacidos vivos ^3,4. Al igual que en el ámbito del trasplante de órganos sólidos y los alotrasplantes compuestos vascularizados (VCA), el rechazo inmunitario es un desafío importante en UTx. ⁵ Varios factores pueden conducir al rechazo del injerto, incluida la insuficiencia microcirculatoria y la estasis venosa, los cuales pueden conducir a una complicación trombótica. En una revisión reciente que estudió la vascularización uterina en el trasplante, Kristek et al. reportaron hasta un 15% de trombosis arterial y un 5% de trombosis venosa⁶. Además, la isquemia fría y caliente son factores críticos que deben abordarse para el éxito del trasplante, ya que la lesión por isquemia-reperfusión (IRI) puede provocar disfunción del injerto y rechazo agudo ^7,8. Los miocitos responden al estrés isquémico produciendo lactato durante un máximo de 6 h⁹, después del cual el daño de las células musculares es irreversible. El impacto de la isquemia fría en el miometrio se ha documentado en estudios clínicos, y se ha demostrado que el uso de una solución intracelular de la Universidad de Wisconsin durante el almacenamiento en frío estático (SCS) mejora la conservación con una mejor respuesta contráctil a la prostaglandina y concentraciones más altas de ATP en comparación con la solución de acetato de Ringer¹⁰. Sin embargo, el impacto de la isquemia fría y caliente sigue siendo poco explorado en UTx.

El SCS sigue siendo el estándar de oro para la preservación de VCA, incluido el útero, y para la mayoría de los trasplantes de órganos sólidos. Sin embargo, en los últimos años, los avances significativos en los sistemas de perfusión de máquinas y las soluciones de conservación han llevado a un cambio de paradigma. En la actualidad existen evidencias sólidas que apoyan que la perfusión dinámica con máquina puede mejorar y prolongar la conservación de órganos sólidos sanos y marginales 11,12,13,14,15. En la actualidad, esta técnica es comúnmente utilizada en la práctica clínica para el trasplante de pulmón, corazón, hígado y riñón 14,16,17,18. La preservación dinámica de órganos demostró múltiples beneficios, incluyendo la minimización de las lesiones por isquemia fría e hipoxia al proporcionar un suministro continuo de oxígeno y nutrientes, eliminar metabolitos tóxicos y mejorar la calidad del injerto y los parámetros de viabilidad^12,19. Se han desarrollado múltiples modalidades, que van desde la hipotermia hasta la perfusión normotérmica en máquina (con o sin portadores de oxígeno), con varias perfusiones disponibles, pero solo unas pocas han sido probadas en el útero²⁰. Para garantizar la contribución sustancial de estas perspectivas de investigación, los modelos quirúrgicos preclínicos relevantes son de crucial importancia.

En este trabajo, se utiliza la máquina de perfusión subnormotérmica (SNMP) como método de preservación dinámica de órganos oxigenados a temperatura ambiente (alrededor de 20 °C) mediante la circulación de un perfusado a través de una bomba de rodillo y un oxigenador. Se emplea un modelo porcino que es relevante para los estudios de UTx y preservación debido a sus similitudes con el sistema reproductor humano en términos de anatomía, fisiología y tamaño de los vasos^21,22. El útero se obtiene después de la muerte circulatoria, lo que proporciona relevancia para la donación después de la muerte cardíaca y sugiere la posibilidad de un retraso en la obtención después de todos los demás órganos sólidos relevantes^23,24. Además, este modelo facilita el desarrollo de estudios de preservación de útero dentro de laboratorios de trasplante establecidos, centrados en otros órganos, aplicando los principios de las "3R"²⁵. El objetivo es establecer un nuevo modelo de preservación basado en pedículos uterinos y evaluar su fiabilidad para la preservación dinámica. Se detallan todos los pasos del procedimiento, desde la histerectomía hasta la preservación, abarcando los puntos clave resaltados sobre el uso de SNMP.

El protocolo que se describe a continuación precedió a un experimento preliminar basado en una sola bomba y un sistema de entrada de "tubo en Y" para ambas arterias uterinas (Figura complementaria 1). Después de 4 h-SNMP, el órgano ganó más del 50% de su peso inicial. El flujo, la presión, la resistencia y la variación del peso se muestran en la Figura complementaria 2. Un solo sistema de perfusión separado en dos entradas no permitía la modulación de cada caudal a la presión de cada lado. En este caso, el SNMP provocó un edema importante en la mitad del órgano (Figura complementaria 3). Este sistema resultó inadecuado para el modelo uterino, en parte porque no debía considerarse un modelo perfectamente simétrico. Por lo tanto, se utilizaron dos sistemas de perfusión en máquina en este protocolo, uno para cada arteria uterina.

Todos los animales recibieron atención humanitaria siguiendo la Guía del Instituto Nacional de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, y los protocolos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Hospital General de Massachusetts. En total, se utilizaron 6 minicerdos hembras de Yucatán con un peso de 30 a 40 kg para la obtención del útero, y cuatro úteros se sometieron a SNMP. Todos los animales fueron heparinizados con una dosis completa (100 UI/kg) antes de la eutanasia. La obtención de órganos ocurrió post-mortem con menos de 60 min de isquemia caliente. Otros órganos podrían haber sido extraídos del mismo donante para diferentes estudios, de acuerdo con los principios de las "3R"²⁵. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los reactivos y equipos utilizados en el protocolo.

1. Preparación preoperatoria (día antes de la cirugía)

1. Prepare la solución de perfusión. Para la perfusión subnormotérmica se utilizó una solución Steen+ optimizada para VCA^26,27. Se utilizó un litro de solución por útero, cuya composición se detalla en la Tabla 1.
   NOTA: Se añade una gran cantidad de hidróxido de sodio a la perfusión con el objetivo de conseguir un pH de alrededor de 7,5-7,6. Este valor es expresamente alto pero necesario ya que el pH tenderá a descender a medida que la máquina circule y se oxigene con una mezcla de cárgenos (95% de oxígeno; 5% de dióxido de carbono).
2. Configure el sistema de perfusión de la máquina (Figura 1). Compruebe si hay fugas y burbujas cuando circule la perfusión.

2. Obtención de útero post mortem

NOTA: Para simular la donación después de la muerte cardíaca y/o la adquisición post-mortem, el animal debe ser sacrificado de acuerdo con las pautas locales de la IACUC. Se debe preferir la exanguinación a la inyección intravenosa de pentobarbital para evitar toxicidad que pueda interferir con el estudio.

1. Coloque al animal sacrificado en posición supina. Frote el área abdominal y coloque paños estériles.
2. Realice una incisión infraumbilical mediana de 10 cm con una cuchilla #20.
3. Abrir el tejido subcutáneo y la aponeurosis con un bisturí eléctrico monopolar.
   NOTA: Se debe prestar atención a no dañar los intestinos al abrir la cavidad abdominal.
4. Apartar el intestino delgado con una gasa quirúrgica y exponer el útero.
   NOTA: La anatomía uterina del modelo utilizado se muestra en la Figura 2A.
5. Proceda de manera similar para los lados izquierdo y derecho de la siguiente manera:
   1. Identificar los vasos uterinos.
      NOTA: La vena uterina se coloca lateralmente a la arteria uterina (Figura 3).
   2. Cree una abertura en el ligamento ancho lateralmente a la vena uterina con pinzas de ángulo recto.
   3. A través de esta abertura, inserte suturas de seda 2-0 para ligar los vasos ováricos y liberar el útero del tejido conectivo circundante en el ligamento ancho mediante cauterización.
   4. Ligara los vasos útero-ováricos con suturas de seda 2-0 y extrae el ovario y la trompa.
   5. Esqueletizar los vasos uterinos y dividirlos lo más cerca posible de los vasos ilíacos internos.
      NOTA: Se debe prestar atención a mantener el pedículo el mayor tiempo posible para facilitar la canulación y anticipar la retracción del pedículo después de que se haya cortado.
   6. Repita los pasos 2.5.1-2.5.5 en el lado opuesto.
6. Extirpa el útero cortando el cuello uterino con un bisturí eléctrico monopolar.
   NOTA: Utilice un tiempo de contacto prolongado para asegurar la coagulación adecuada de los vasos del cuello uterino, evitando fugas durante la perfusión.

3. Preparación para la perfusión

1. En una mesa auxiliar, dilate ambas arterias uterinas con un dilatador microquirúrgico e inserte un angiocatéter. Asegure la canulación con bridas de seda 3-0 (Figura 2B).
   NOTA: En este caso, se utilizó un angiocatéter de 18 G para todas las arterias. Se debe tener cuidado de no insertar el catéter demasiado lejos para evitar la canulación selectiva, ya que la bifurcación es relativamente cercana. Las venas uterinas no están canuladas, ya que el flujo venoso es suficiente para mantener abierto el lumen de estos vasos, lo que permite una fácil recolección. Además de ahorrar tiempo, la canulación traumática puede provocar daño vascular y afectar potencialmente el flujo venoso.
2. Enjuague lentamente y manualmente ambas arterias uterinas con 20 ml de solución de heparina en cada lado hasta que todos los vasos se laven y las salidas estén limpias.
   NOTA: Se debe prestar atención a no enjuagar con alta presión, lo que puede provocar lesiones microvasculares e insuficiencia de perfusión.
3. Pesa el útero.

4. Máquina de perfusión subnormotermo

NOTA: Para el útero, se requieren dos sistemas independientes de perfusión a máquina. Cada arteria uterina está conectada a un sistema de perfusión compuesto por una bomba de rodillos, un oxigenador, una trampa de burbujas y un sensor de presión. El perfusado en un reservorio circula a través de tubos de silicona conectados a los elementos enumerados anteriormente antes de correr a través del órgano a través de la arteria uterina hasta la vena uterina a cada lado, donde el perfusionado sale y se libera en el mismo reservorio.

1. Conecte el útero a los sistemas de perfusión de la máquina conectando las cánulas de la arteria uterina al tubo de entrada (Figura 1).
2. Con la bomba de rodillos, ajuste el caudal a bajo (2,5-4,0 mL/min) para mantener una presión arterial constante entre 25-35 mmHg.
3. Evalúe los parámetros de viabilidad en cada punto de tiempo predefinido tanto en el flujo de entrada como en el de salida utilizando una jeringa de 1 mL y analizando muestras con la máquina del sistema de gases en sangre [por ejemplo, métricas de gases en sangre (pH, pCO₂, pO₂, lactato, exceso de bases, bicarbonato), glucosa, sodio, potasio, calcio, cloruro].
   NOTA: En este protocolo, la perfusión dura 4 h, y se toman muestras del flujo de entrada y del flujo de salida cada 30 min.
4. Pesar el útero al final de la perfusión.

Durante la perfusión, el sistema se conectó a un sensor de presión que registró la presión durante el experimento. La presión se registró inicialmente para un sistema libre de útero, que se restó de los registros de presión durante la perfusión uterina para obtener la presión real del órgano. El caudal se adaptó para mantener la presión dentro del rango deseado y se controló mediante la bomba de rodillos. La resistencia se calculó mediante la fórmula R = P / Q (R: resis...

El trasplante de útero, a menudo considerado parte de la VCA, se ha desarrollado rápidamente en los últimos años. Paralelamente, se comenzó a explorar la perfusión mecánica en VCA, ya que demostró pruebas sólidas en la mejora de la preservación de órganos sólidos. La perfusión con máquina hipotérmica y subnormotérmica ha permitido hasta 24 h de conservación en modelos porcinos de VCA miocutáneo y que contiene hueso 26,27,28.

Todos los autores no tienen ningún interés financiero que declarar.

Este trabajo fue financiado parcialmente por el Instituto Nacional de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) en virtud de la subvención n.º R01AR082825 (BEU) y el Hospital Shriners para Niños 84308 (YB). HO y YB recibieron financiación de la Fondation des Gueules Cassées. Se agradece enormemente el apoyo de la Société Française de Chirurgie Plastique, Reconstructrice et Esthétique (SOFCPRE, Francia) y del CHU de Rennes (Francia) a YB.