In vivo (İn canlı) Kısmen Kısıtlanmış Larva Zebra Balıklarında Duyusal Stimülasyonla İndüklenen Nöral Aktivitenin Konfokal Floresan Görüntülemesi

Burada, konfokal mikroskopi kullanarak GCaMP kalsiyum göstergelerini eksprese eden transgenik zebra balıklarının beyin bölgelerindeki nöral aktiviteyi incelemek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Zebra balığı larvaları, davranışın sinirsel mekanizmalarını incelemek için umut verici bir omurgalı model sistemidir. Yarı saydamlıkları ve nispeten basit nöral devreleri, davranışın hücresel analizlerinde optogenetik tekniklerin kullanılmasını kolaylaştırır. GCaMP6'lar gibi in vivo nöral aktivitenin floresan göstergeleri, larva zebra balıklarında basit davranışlarla ilişkili nöral aktiviteyi incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, transgenik hat Tg(elav3:GCaMP6s) kullanarak yarı kısıtlı zebra balığı larvalarında duyusal kaynaklı aktiviteyi tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Özellikle, arka beyin ve omurilik sınırındaki bir beyin bölgesinde sağlam, tekrarlanabilir bir floresan tepkisi indüklemek için kimyasal ajan alil izotiyosiyanat kullanıyoruz. Bir dizi davranışsal paradigma sırasında nöral aktivitenin optik olarak izlenmesi için GCaMP6'ların potansiyel kullanımlarını ve bu tekniğin sınırlamalarını tartışıyoruz. Protokolümüz, larva zebra balığı beynindeki dinamik, davranışla ilgili in vivo nöral aktiviteyi izlemek için erişilebilir bir yaklaşımın ana hatlarını çizmektedir.

Zebra balığı, ayrıntılı hücresel-moleküler nörobiyolojik araştırmalar için izlenebilirliğe sahip omurgalı bir hayvan modelini temsil eder. Larva zebra balığı, döllenmeden 5 gün sonra (dpf) ~ 100.000 nörona sahiptir, bu da memeli beyinlerinden önemli ölçüde daha azdır. Ayrıca, zebra balığı nispeten yarı saydamdır, bu da nöral yapı ve işlevin optik çalışmalarını kolaylaştıran bir özelliktir ^1,2,3,4,5. Zebra balıklarında kullanılmak üzere, yüksek kaliteli kalsiyum göstergeleri⁶, voltaj sensörleri ^7,8 ve nöral aktivitenin aktiviteye bağlı belirteçleri ^{9,10,11,12,13} dahil olmak üzere çeşitli optogenetik araçlar geliştirilmiştir. Bu araçlar, genetik modifikasyonlara ^14,15,16,17 uygunluk ve zebra balığı larvalarının banyo solüsyonlarında^{bulunan kimyasalları emmeye hazır olma gibi bu modelin sahip} olduğu diğer avantajları tamamlayıcı niteliktedir 18,19,20,21.

Zebra balığı optik fizyolojisi için, özellikle iki foton, ışık tabakası ve konfokal mikroskopi olmak üzere çeşitli yöntemler yararlıdır. Bu teknolojilerin her biri, birbiriyle ilişkili iki çözünürlük problemini dengelemelidir: çevreleyen doku tarafından ışık saçılımı dahil olmak üzere optik erişim ve özellikle milisaniyenin altındaki ölçekte aksiyon potansiyeli kinetiğini yakalamak için^{örnekleme hızı 22}. İki foton mikroskobu kullanılarak in vivo kalsiyum görüntülemede çarpıcı gelişmeler olmuştur, ancak bu yöntem genellikle <1^mm2'lik bir görüş alanıyla sınırlıdır ve tipik olarak, yalnızca tek bir derinlik düzlemi elde edilebilir, böylece nöral devrenin geniş bölgelerinde aktivitenin yakalanmasını sınırlar²². Işık tabakası mikroskobu için, beyindeki hemen hemen tüm nöronların aktivitesini kaydetme potansiyeli, iki foton mikroskobunun görüş alanı sınırlamasını çözer, ancak mevcut kamera hızları, larva zebra balığında beyin hacmi başına 40 düzlemde yakalamayı fiziksel olarak saniyede kabaca üç beyin hacmiyle sınırlar ^1,23. Konfokal mikroskopi, hem derinlik çözünürlüğü hem de yakalama hızı açısından iki foton ve ışık tabakası mikroskobuna göre daha düşüktür. Konfokal mikroskopi, dünya çapında laboratuvarlara yaygın erişilebilirlik ve cFos ve p-ERK⁹ gibi nöral aktivite raporlayıcılarını kullanarak nöral aktivitenin tüm beyin rekonstrüksiyonlarını gerçekleştirme kapasitesi avantajlarına sahiptir. Ayrıca, küçük beyin bölgeleri hedeflenirse, konfokal mikroskop nöral aktivitenin yeterli zamansal çözünürlüğünü sağlayabilir.

Bu makale, GCaMP6'ları pan-nöronal olarak eksprese eden transgenik zebra balıklarında nöral aktiviteyi kaydetmek için konfokal mikroskopi kullanan bir yöntemi açıklamaktadır. ^{24,25,26,27,28,29} nöral yollarının işlevini anlamak için zebra balığı larvalarını kullanan birkaç benzer protokol geliştirilmiştir. Hızlandırılmış görüntüleme, kalsiyum dinamiğinin floresan göstergeleri ve canlı görüntüleme gibi bu protokollerin birçoğunun temel özellikleri, caydırıcı bir kimyasal tahriş edici olan alil izotiyosiyanata (AITC) yanıt olarak zebra balığı merkezi sinir sistemindeki küçük bir nöron popülasyonundaki nöral aktiviteyi ölçmek için birleştirilmiştir 11,26,27,29,30,31. AITC, arka beyin bölgesine odaklanan beyin çapında bir yanıt ortaya çıkarır¹¹. Arka beyne sadece kaudal olan bir nöron kümesi, harekette ve AITC'ye uzun süreli bir yanıtta rol oynar. Bu tepki, caydırıcı uyaranın³⁰ kaldırılmasından daha uzun sürer. Görüş alanını kısıtlayarak, GCaMP6'ları ifade eden nöronlardaki floresan değişikliğinin yansıttığı gibi bu sinir kümesindeki sinirsel aktiviteyi tespit etmeyi başardık. Konfokal mikroskopi kullanarak yeterli uzay-zamansal çözünürlük elde etmek için teknikler, kılavuzlar ve en iyi uygulamalar sunuyoruz. Ek olarak, optik kayıt yöntemimizin sınırlamalarını tartışıyoruz. Bu sınırlamalara rağmen, yöntem, hafıza ve sensorimotor işleme dahil olmak üzere çeşitli nörobiyolojik olayların araştırılmasına izin vermelidir.

Hayvanları kullanan tüm prosedürler, California Eyalet Üniversitesi, Fullerton'daki Kurumsal Hayvan Bakımı Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (Protokol # 2023-1310).

1. Larva zebra balığının düşük erime noktalı agarozda sahnelenmesi

1. Pan-nöronal olarak Tg(elav3:GCaMP6s)⁶ eksprese eden yetişkin transgenik hayvanları, kurumsal hayvan bakımı yönergelerine uygun olarak iki erkek ila iki dişi ile yetiştirin. Yetişkinler özel üreme odalarına yerleştirilir, böylece serbest bırakılan yumurtalar, yetişkinlerin erişemeyeceği sahte bir tabana sahip daha düşük bir odada yakalanır. İlk ışıkta veya bir ayırma bölücü çıkarıldığında, dişiler yumurtaları serbest bırakır ve erkekler sahte dipte yakalanan yumurtaları döller.
2. Yetişkinleri çıkarın ve bir yumurta süzgeci kullanarak döllenmiş yumurtaları toplayın ve embriyo (E3) ortamına yerleştirin (5 mM NaCl, 0.33 mM MgSO4, 0.33 mM CaCl2, 0.17 mM KCl, 1 mM HEPES, %0.00001 metilen mavisi, pH 7.0)³⁰ 14 saat ışık/28.5 °C'de 10 saat karanlık ile bir kuluçka makinesinin içine
   NOT: Kullanılan E3 tarifi, floresansı etkilemeyen veya herhangi bir önemli otomatik floresan sinyaline yol açmayan düşük bir metilen mavisi konsantrasyonuna sahiptir. GCaMP6s transgenik hattının sağladığı doğal yarı saydamlık nedeniyle protokolde belirtilen gelişim yaşlarında 1-fenil 2-tiyoüre (PTU) kullanımına gerek yoktur.
3. Döllenmeden 2-7 gün sonra (dpf) E3 ortamında çözülmüş %3 düşük erime noktalı agaroz kullanarak hayvanları monte edin. Zebra balığının organizmaya zarar vermeden manipüle edilebileceği bir sıcaklığa kadar ısı agarozu. Düşük erime noktalı agaroz soğumadan ve katılaşmadan önce (<1 dakika), larvaları sırt tarafı yukarı bakacak şekilde cam tabanlı bir Petri kabına yerleştirin, böylece incelenecek beyin bölgesi Şekil 1'de gösterildiği gibi hedefe mümkün olduğunca yakın olur. Deneye bağlı olarak, tipik olarak, deney grubu başına 8 ila 10 zebra balığı yeterlidir.
   NOT: Bu protokolde hayvanlara anestezi uygulanmamıştır.
4. Agaroz larva yerine oturduktan sonra (yaklaşık 2 ila 3 dakika), 5 mL E3 çözeltisi ekleyin. Ardından, agarozu deney protokolünün gerektirdiği şekilde bir neşter ile kesin.
   NOT: Zebra balığının hangi kısımlarının kısıtlamadan kurtarılması ve/veya farklı türde bir uyaran alması gerektiğine bağlı olarak, agarın farklı kısımları kesilmelidir.
5. Zebra balığının bulunduğu Petri kabını konfokal mikroskop aşamasına getirin ve balığın 20 dakika boyunca alışmasına izin verin.

2. Uyaran uygulaması ile konfokal mikroskopi altında kurulum ve görüntüleme

1. Alışma süresinden sonra, balığı bir ışık kaynağı (~ 475 nm) olan parlak bir alan kullanarak oda sıcaklığında 40x (NA 1.0) suya daldırma hedefinin altında ortalayın.
2. Konfokal mikroskop edinim ayarları, floresan molekülünün niteliklerine ve ekspresyon seviyesine, dokunun derinliğine ve optik özelliklerine, görüş alanının boyutuna ve kayıt hızına bağlı olacaktır. Deneysel ihtiyaçlara göre yayılan ışığın en iyi şekilde yakalanmasını sağlamak için aralık göstergesini kullanarak uygun ayarları belirleyin.
3. Floresan ışığı optimum aralıkta yakalamak için lazer gücünün ve ana kazancın uygun şekilde ayarlandığından emin olun, böylece GCaMP6'lara bağlı floresan sinyalinin gereksiz kaybını önleyin. Uygun ayarları belirlemek için aşağıda verilen temel konfokal ayarlar ve faktörler listesini kullanın.
   1. İğne deliği boyutu: Bunu kullanılan hedefe göre belirleyin ve diğer odak düzlemlerini kısıtlarken tek bir odak düzlemini kabul edecek şekilde ayarlayın. Bu protokol için 32 μm'lik bir iğne deliği kullanılır.
   2. Lazer gücü ve dalga boyu: Lazer gücünü, floresan molekülünün ifade seviyesine ve dokunun derinliğine ve optik özelliklerine göre ayarlayın. Lazerin fotodetektörün menzilini aşmadığından emin olmak için menzil göstergesini kullanın. Uyarma dalga boyunu, floresan molekülünü en iyi şekilde uyaran ışığın dalga boyuna ayarlayın. Bu deney için, balıklar GCaMP6s transgeni için heterozigot olduğundan ve ekspresyon seviyeleri düşük olduğundan, 488 nm dalga boyunda, 650 ana kazançta% 5 lazer gücü kullanın. Güçlü transgen ekspresyonu ile lazer gücü %1,5 ila %3 arasında değişir ve bu genellikle yeterlidir.
      NOT: Lazer gücü çok düşük ayarlanırsa, bilgi (fotoçoğaltıcı tüp tarafından algılanan ışık) kaybolacaktır. Lazer gücü çok yükseğe ayarlanırsa, yayılan ışık dedektörün menzilini aşabilir veya örneğe zarar verebilir (foto ağartıcı).
   3. Ana kazanç: Ana kazanç, fotodetektörün hassasiyetini belirler. Ana kazancın çok yüksek ayarlanmadığından ve böylece fotodetektörün menzilini aşmadığından emin olmak için aralık göstergesini kullanın. Bu deney için ana kazanç 650 olarak ayarlanmıştır.
   4. Görüş alanı: İlgilenilen dokuyu yakalamak için görüş alanının yeterince büyük olduğundan emin olun. Bu, genellikle konfokal mikroskoplar için önemli bir sınırlamadır, çünkü görüş alanının boyutu, Şekil 2'de gösterildiği gibi yakalama hızını sınırlayacaktır. AITC ile yapılan deneyler için görüş alanını 79.86^μm2 olarak ayarlayın.
   5. Yakalama hızı: Yakalama hızı arttıkça, fotodetektör tarafından yakalanan ışık miktarı azalacaktır. Daha az ışık yakalandıkça, görüntü kalitesi düşecektir. Yakalama hızının, görüntünün kalitesini ve ilgilenilen fizyolojik olayı yakalamak için gereken hızı dengelediğinden emin olun. Burada çekim hızı 1.20 f/s olarak ayarlanmış.
4. Omuriliğin rostral kısmındaki commissura infima Halleri'ye bir nöronal küme kaudal üzerinde görüş alanını ortalayın³⁰. Bu küme ~2.5 dpf ile oldukça küçüktür, ancak daha sonra geliştirme aşamasında çok daha büyüktür (7 dpf).
   NOT: Adım 1'deki agaroz montajı yetersiz ise, yani hayvan agarozun içinde belirli bir açıda veya çok derinde konumlandırılmışsa, görüntü kalitesi olumsuz etkilenecektir. İyi yerleştirilmiş bir hayvanda zebra balığı omuriliğinin bir görüntüsü ve optimal olmayan bir şekilde yerleştirilmiş bir zebra balığında omuriliğin zıt bir görüntüsü Şekil 3'te gösterilmektedir.
5. Piksel başına 0,119 μm² uzamsal çözünürlükle sn başına 1,20 kare (fps) hızında 79,86 μm² görüş alanı kullanarak bir zaman serisi taraması gerçekleştirin. İstenilen uygulamaya göre görüş alanının boyutunu ve görüntü alma hızını ayarlayın.
6. Görüntülemenin başlamasından 2 dakika sonra, bir pipet ile tabağa 41.67 μL stok AITC çözeltisi (10 μM nihai konsantrasyon) veya E3 çözeltisi ekleyin. Hızlandırılmış görüntüleme ile ilgilenilen bölgedeki GCaMP6s aktivitesindeki herhangi bir değişikliği gözlemlemek için ~30 saniye boyunca kayda devam edin. Kayıt tamamlandıktan sonra, hayvanı agarozdan kurtarın ve kurumsal hayvan bakım yönergelerine göre ötenazi yapın.
   NOT: GCaMP6s aktivitesini kaydederken, konfokal ışığın kendisi bir uyarıcı olabilir. Görüntüleme sonuçlarının analizinde bu dikkate alınmalıdır. Kayıt süresi, istenen süre için gerektiği gibi ayarlanabilen, kare sayısının ve her karenin yakalama hızının bir fonksiyonudur.

3. FIJI kullanarak GCaMP sinyalinin analizi

1. Kayıttan sonra, çıktı aşağı akış FIJI analizi için .tif dosya biçiminde değilse, görüntü dosyalarını mikroskop yazılım paketinden .tif dosyaları olarak dışa aktarın.
2. Nöral izlerin analizi için FIJI'yi indirin. FIJI'yi açın, .czi dosyalarını programa aktarın ve istendiğinde BioFormats eklentisindeki varsayılan ayarları kullanın.
3. İlgili Simgelerine tıklayarak Circle veya Freehand araçlarını kullanarak ilgilendiğiniz bir alanı/nöronu vurgulayın. (Simgelerin üzerine gelindiğinde, programdaki aracın adı yanıp sönecektir.)
   NOT: İlgi alanı büyüklük olarak değiştiği için sabit alanlar/daireler mümkün değildir. Thunder paketi³² gibi zaman içinde floresan değişikliklerinin voksel olarak kaydedilmesine izin veren yazılım, bireysel nöronların algılanmasına izin verebilir; Bununla birlikte, mevcut deneydeki ~ 20 nöron için, zar sınırlarının kör bir gözlemci tarafından tespit edilmesi, otomatik bir algılama sisteminden daha üstün olacaktır.
4. Bir ROI seçildikten sonra, FIJI araç çubuğunda ROI Yöneticisi'> Analiz > Araçları'na tıklayın. Bundan sonra, Ekle [t]'ye tıklayın ve seçilen ROI, ROI Yöneticisi penceresine eklenecektir.
5. ROI Yöneticisi'nde Daha Fazla > Çoklu Ölçüm'e tıklayın. Ayarları varsayılan olarak bırakın ve Tamam'a tıklayın. FIJI, Python kullanılarak bir CSV dosyası olarak veya bir elektronik tabloda ham veri olarak manipüle edilebilecek ham veriler üretecektir.
6. Ham verileri normalleştirmek ve belirli bir ilgi alanı için sinirsel bir iz olarak temsil etmek için, uyarandan önceki 2 dakikalık pencerenin son ~30 s değerlerinin ortalamasını alın ve tüm uyaran sonrası değerleri bu ortalama temel değere normalleştirin:
   normalleştirilmiş floresan yoğunluğu = (uyaran sonrası belirli bir ilgilenilen bölgenin anlık floresansı)/(2 dakikalık aralıklı bir ön uyaranın ~30 s'lik ortalama floresansı)
7. Verileri Şekil 4'te gösterildiği gibi nöral izler olarak çizin.
   NOT: Beynin bir hacminin kaydedildiği ışıklı levha mikroskobu gibi bazı mikroskop türlerinde, hareket artefaktları, bir referans beyin hacmine işlem sonrası uzamsal kayıt yoluyla ele alınır ^1,11. Ancak, yalnızca tek bir düzlemden kayıt yaptığımız için, hareket artefaktları için herhangi bir ayarlama yapılamaz. Bu nedenle, burada gösterilen sonuçlar için hiçbir çerçeve kaldırılmamıştır. Bununla birlikte, hareket artefaktları sonuçları önemli ölçüde değiştirirse, otomatik sistemler hareket artefaktları^{1, 11} olan çerçeveleri tanımlayabilir ve düzeltebilir veya kör bir gözlemci bu tür çerçeveleri kaldırabilir.

Alil izotiyosiyanat uygulaması, larva zebra balıklarında kalsiyumla ilişkili bir nöral sinyale neden olur
AITC'nin uygulanması (adım 2.6), larva zebra balığının^beyninde GCaMP6'larla ilişkili nöral aktivitede yaygın bir artışa neden olur ^11,30. Şekil 4'te gösterildiği gibi, AITC'yi uyguladıktan sonra beynin küçük bir bölgesinde floresan sinyalinin arttığı...

Konfokal mikroskopi ile birlikte GCaMP6'lar kullanılarak zebra balığı larvalarının beyinlerinde nöral aktivitenin kaydedilebileceğini gösterdik; GCaMP'lerin daha yavaş kinetiği nedeniyle gereken daha düşük yakalama hızları, gözlemlenen beyin alanını azaltarak telafi edilebilir⁶. Daha hızlı zamansal dinamiklere (yani GCaMP6f) sahip raportörler mevcuttur, ancak üstün zamansal çözünürlük genellikle azaltılmış floresan sinyali

Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan ederler.

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (SC2GM1304854) ACR'ye bir hibe ve Ulusal Bilim Vakfı'ndan (2050850) DLG'ye bir hibe ile desteklenmiştir.