В естественных условиях Конфокальная флуоресцентная визуализация нейронной активности, вызванной сенсорной стимуляцией у частично сдерживаемых личинок данио-рерио

Здесь мы представляем подробный протокол исследования нейронной активности в областях мозга трансгенных рыбок данио, экспрессирующих кальциевые показатели GCaMP с помощью конфокальной микроскопии.

Личинки данио-рерио являются перспективной модельной системой позвоночных для изучения нейронных механизмов поведения. Их полупрозрачность и относительно простая нейронная схема облегчают использование оптогенетических методов в клеточном анализе поведения. Флуоресцентные индикаторы нейронной активности in vivo , такие как GCaMP6s, широко используются для изучения нейронной активности, связанной с простым поведением личинок рыбок данио. В данной работе мы представляем протокол обнаружения сенсорно-индуцированной активности у полусдержанных личинок данио-рерио с использованием трансгенной линии Tg(elav3:GCaMP6s). В частности, мы используем химическое вещество аллилизотиоцианат, чтобы вызвать устойчивый, воспроизводимый флуоресцентный ответ в области мозга на границе заднего и спинного мозга. Мы обсуждаем потенциальное использование GCaMP6 для оптического мониторинга нейронной активности в различных поведенческих парадигмах и ограничения этого метода. Наш протокол описывает доступный подход к мониторингу динамической, связанной с поведением нейронной активности in vivo в мозге личинки данио-рерио.

Рыбки данио представляют собой модель позвоночного животного с податливостью для детальных клеточно-молекулярных нейробиологических исследований. Личинки данио обладают ~100 000 нейронов через 5 дней после оплодотворения (dpf), что значительно меньше, чем мозг млекопитающих. Кроме того, рыбки данио относительно полупрозрачны, что облегчает оптические исследования нейронной структуры и функций 1,2,3,4,5. Для использования у рыбок данио было разработано несколько оптогенетических инструментов, в том числе высокоточные показатели кальция⁶, датчики напряжения ^7,8 и активно-зависимые маркеры нейронной активности ^{9,10,11,12,13}. Эти инструменты дополняют другие преимущества, которыми обладает данная модель, такие как податливость к генетическим модификациям 14,15,16,17 и готовность, с которой личинки рыбок данио рерио поглощают химические вещества, присутствующие в растворах для купания 18,19,20,21.

Для оптической физиологии рыбок данио полезны различные методы, в частности, двухфотонная, световая листовая и конфокальная микроскопия. Каждая из этих технологий должна уравновешивать две взаимосвязанные проблемы разрешения: оптический доступ, включая рассеяние света окружающими тканями, и скорость дискретизации, особенно для захвата потенциальной кинетики действия^{в масштабе} долей миллисекунды. Были достигнуты значительные успехи в визуализации кальция in vivo с использованием двухфотонной микроскопии, но этот метод часто ограничен полем зрения <1^мм2, и, как правило, можно получить только одну плоскость глубины, что ограничивает захват активности в больших областях нейронной сети²². Для световой листовой микроскопии возможность записи активности почти всех нейронов в мозге устраняет ограничение поля зрения двухфотонной микроскопии, но современные скорости камеры физически ограничивают захват примерно тремя объемами мозга в секунду при 40 плоскостях на объем мозга у личинки данио-рерио ^1,23. Конфокальная микроскопия уступает как по глубинному разрешению, так и по скорости захвата двухфотонной и световой листовой микроскопии. Преимущества конфокальной микроскопии заключаются в широкой доступности лабораторий по всему миру и возможности для реконструкции нейронной активности всего мозга с использованием репортеров нейронной активности, таких как cFos и p-ERK⁹. Кроме того, если мишенью являются небольшие области мозга, конфокальный микроскоп может обеспечить адекватное временное разрешение нейронной активности.

В настоящей статье описывается метод, который использует конфокальную микроскопию для регистрации нейронной активности у трансгенных рыбок данио-рерио, экспрессирующих GCaMP6s паннейронально. Несколько подобных протоколов с использованием личинок рыбок данио были разработаны для понимания функции нейронных путей 24,25,26,27,28,29. Ключевые особенности некоторых из этих протоколов, таких как покадровая визуализация, флуоресцентные индикаторы динамики кальция и живая визуализация, были объединены для измерения нейронной активности в небольшой популяции нейронов в центральной нервной системе рыбок данио в ответ на аллилизотиоцианат (AITC), аверсивный химический раздражитель 11,26,27,29,30,31 . АКИТ вызывает реакцию всего мозга, сфокусированную в области заднего мозга¹¹. Один кластер нейронов, расположенный ближе к заднему мозгу, играет роль в передвижении и длительной реакции на AITC. Эта реакция длится дольше, чем устранение аверсивного стимула³⁰. Ограничивая поле зрения, нам удалось обнаружить нейронную активность в этом нейронном кластере, которая отражается в изменении флуоресценции в нейронах, экспрессирующих GCaMP6. Мы предоставляем методы, рекомендации и передовой опыт для достижения достаточного пространственно-временного разрешения с помощью конфокальной микроскопии. Кроме того, мы обсудим ограничения нашего оптического метода записи. Несмотря на эти ограничения, метод должен позволить исследовать различные нейробиологические феномены, включая память и сенсомоторную обработку.

Все процедуры с использованием животных были одобрены Комитетом по использованию институционального ухода за животными в Калифорнийском государственном университете в Фуллертоне (протокол # 2023-1310).

1. Стадирование личинок данио рерио в агарозе с низкой температурой плавления

1. Разводить взрослых трансгенных животных с паннейронально экспрессирующим Tg(elav3:GCaMP6s)⁶ от двух самцов до двух самок в соответствии с рекомендациями по уходу за животными в учреждениях. Взрослых особей помещают в специальные камеры для разведения так, чтобы выпущенные яйца захватывались в нижней камере с двойным дном, недоступным для взрослых особей. С первыми лучами солнца или при удалении разделительной перегородки самки выпускают икру, а самцы оплодотворяют икру, захваченную в ложном дне.
2. Извлеките взрослых особей и соберите оплодотворенные яйца с помощью яичного ситечка и поместите в среду для эмбрионов (E3) (5 мМ NaCl, 0,33 мМ MgSO4, 0,33 мМ CaCl2, 0,17 мМ KCl, 1 мМ HEPES, 0,00001% метиленового синего, pH 7,0)³⁰ при 14 ч свете/10 ч в темноте при 28,5 °C внутри инкубатора
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используемый рецепт E3 имеет низкую концентрацию метиленового синего, которая не влияет на флуоресценцию и не приводит к какому-либо значительному автофлуоресцентному сигналу. Мы не требуем использования 1-фенил2-тиомочевины (ПТУ) в возрастах развития, указанных в протоколе, из-за естественной прозрачности, обеспечиваемой трансгенной линией GCaMP6s.
3. Через 2-7 дней после оплодотворения (ООПТ) животных сажают с использованием 3% агарозы с низкой температурой плавления, растворенной в среде Е3. Нагрейте агарозу до такой температуры, при которой рыбками данио можно манипулировать без ущерба для организма. До того как низкая температура плавления агарозы остынет и затвердеет (<1 мин), расположите личинки тыльной стороной вверх в чашке Петри со стеклянным дном так, чтобы исследуемая область мозга была как можно ближе к объекту, как показано на рисунке 1. В зависимости от эксперимента, как правило, достаточно от 8 до 10 рыбок данио на одну экспериментальную группу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Животные не подвергались анестезии в этом протоколе.
4. После того как агароза застынет с личинкой на месте (примерно от 2 до 3 минут), добавьте 5 мл раствора Е3. Затем разрежьте агарозу скальпелем, как того требует протокол эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Различные части агара должны быть отрезаны, в зависимости от того, какие части данио-рерио необходимо освободить от ограничений и/или получить другой тип стимула.
5. Переместите чашку Петри с рыбками данио на столик для конфокального микроскопа и дайте рыбе акклиматизироваться в течение 20 минут.

2. Постановка и визуализация в условиях конфокальной микроскопии с применением стимула

1. После периода акклиматизации центрируйте рыбу под объективом погружения в воду 40x (NA 1.0) при комнатной температуре, используя светлое поле с источником света (~475 нм).
2. Настройки регистрации с помощью конфокального микроскопа будут зависеть от качества и уровня экспрессии флуоресцентной молекулы, глубины и оптических свойств ткани, размера поля зрения и скорости записи. Определите подходящие настройки с помощью индикатора дальности, чтобы обеспечить оптимальный захват излучаемого света в соответствии с экспериментальными потребностями.
3. Обеспечьте правильную регулировку мощности лазера и коэффициента усиления для захвата флуоресцентного света в оптимальном диапазоне, тем самым предотвращая ненужную потерю сигнала флуоресценции, зависящего от GCaMP6s. Используйте приведенный ниже список ключевых конфокальных настроек и факторов, чтобы определить подходящие настройки.
   1. Размер отверстия: Определите это по используемому объективу и настроенному на принятие одной фокальной плоскости при ограничении других фокальных плоскостей. Для этого протокола используется точечное отверстие размером 32 мкм.
   2. Мощность лазера и длина волны: Регулируйте мощность лазера в зависимости от уровня экспрессии флуоресцентной молекулы, а также глубины и оптических свойств ткани. Используйте индикатор дальности, чтобы убедиться, что лазер не выходит за пределы диапазона фотоприемника. Установите длину волны возбуждения на длину волны света, которая оптимально возбуждает флуоресцентную молекулу. Для этого эксперимента, поскольку рыбы были гетерозиготными по трансгену GCaMP6s и уровни экспрессии были низкими, использовали 5% мощности лазера на длине волны 488 нм, коэффициент усиления 650. При сильной экспрессии трансгенов мощность лазера колеблется от 1,5% до 3%, что обычно достаточно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если мощность лазера установлена слишком низкой, информация (свет, обнаруженный фотоумножителем) будет потеряна. Если мощность лазера установлена слишком высоко, излучаемый свет может выйти за пределы диапазона действия детектора или повредить образец (фотоотбеливатель).
   3. Усиление мастера: усиление мастера определяет чувствительность фотоприемника. Используйте индикатор диапазона, чтобы убедиться, что коэффициент усиления мастера не установлен слишком высоко, тем самым выходя за пределы диапазона фотоприемника. Для этого эксперимента общее усиление установлено на 650.
   4. Поле зрения: Убедитесь, что поле зрения достаточно велико для захвата интересующей ткани. Это основное ограничение для конфокальных микроскопов в целом, поскольку размер поля зрения ограничивает скорость съемки, как показано на рисунке 2. Для экспериментов с использованием AITC установите поле зрения на 79,86^мкм2.
   5. Скорость съемки: По мере увеличения скорости съемки количество света, улавливаемого фотодетектором, будет уменьшаться. Чем меньше света захватывается, тем хуже качество изображения. Убедитесь, что скорость съемки уравновешивает качество изображения и скорость, необходимую для съемки интересующего физиологического события. Здесь скорость съемки установлена на 1,20 f/s.
4. Центрируйте поле зрения на нейронном кластере каудально по отношению к commissura infima Halleri в ростральном отделе спинного мозга³⁰. Этот кластер довольно мал (~2,5 dpf), но на более поздних этапах разработки он значительно больше (7 dpf).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если монтаж агарозы на шаге 1 является неоптимальным, то есть животное расположено под углом или слишком глубоко в агарозе, это отрицательно скажется на качестве изображения. Изображение спинного мозга данио-рерио у хорошо расположенного животного и контрастное изображение спинного мозга у неоптимально расположенной данио-рерио показаны на рисунке 3.
5. Проведите сканирование временных рядов с использованием поля зрения 79,86^мкм2 со скоростью 1,20 кадра в секунду (кадров в секунду) с пространственным разрешением 0,119^мкм2 на пиксель. Отрегулируйте размер поля зрения и скорость получения изображения в соответствии с желаемым приложением.
6. Через 2 мин после начала визуализации добавьте в чашку с помощью пипетки 41,67 мкл либо исходного раствора AITC (конечная концентрация 10 мкМ), либо раствора E3. Продолжайте запись в течение ~30 секунд, чтобы наблюдать за любыми изменениями активности GCaMP6s в интересующей области с помощью покадровой съемки. После завершения записи освободите животное от агарозы и усыпьте его в соответствии с рекомендациями по уходу за животными в учреждении.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При записи активности GCaMP6s сам по себе конфокальный свет может быть стимулом. Это необходимо учитывать при анализе результатов визуализации. Время записи является функцией количества кадров и скорости захвата каждого кадра, которую можно регулировать по мере необходимости для желаемого времени.

3. Анализ сигнала GCaMP с использованием FIJI

1. Если после записи выходные данные не представлены в формате файла .tif для последующего анализа по методу FIJI, экспортируйте файлы изображений в виде файлов .tif из программного комплекса микроскопа.
2. Скачать FIJI для анализа нейронных следов. Откройте FIJI, импортируйте файлы .czi в программу и при появлении запроса используйте настройки по умолчанию в плагине BioFormats.
3. Выделите интересующую область/нейрон с помощью инструментов «Круг» или «От руки», нажав на соответствующие значки. (При наведении курсора на иконки будет мигать название инструмента в программе.)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку область интереса различается по размеру, фиксированные области/круги невозможны. Программное обеспечение, позволяющее регистрировать флуоресцентные изменения с течением времени в виде вокселей, такое как пакет³² Thunder, может позволить обнаруживать отдельные нейроны; Тем не менее, для ~20 нейронов в текущем эксперименте обнаружение границ мембраны слепым наблюдателем, вероятно, будет лучше, чем с помощью автоматизированной системы обнаружения.
4. После выбора ROI на панели инструментов FIJI нажмите «Анализ > Инструменты» > Менеджер ROI. После этого нажмите Добавить [t], и выбранный ROI будет добавлен в окно Менеджер ROI.
5. В Менеджере ROI нажмите кнопку Дополнительно > Мультимера. Оставьте настройки по умолчанию и нажмите OK. FIJI будет производить необработанные данные, которыми можно манипулировать как файлом CSV с помощью Python или как необработанными данными в электронной таблице.
6. Чтобы нормализовать исходные данные и представить их в виде нейронной трассировки для заданной области интереса, усредните последние ~30 с значений 2-минутного окна до стимула и нормализуйте все значения после стимула до этого среднего базового значения:
   нормализованная интенсивность флуоресценции = (мгновенная флуоресценция данной области интереса после стимула)/(средняя флуоресценция ~30 с интервала 2 минуты до стимула)
7. Отобразите данные в виде нейронных трасс, как показано на рисунке 4.
   Примечание: В некоторых типах микроскопии, таких как световая листовая микроскопия, где регистрируется объем мозга, артефакты движения рассматриваются путем постобработки пространственной регистрации до эталонного объема мозга ^1,11. Однако, поскольку мы записываем только с одной плоскости, никакие корректировки для артефактов движения не могут быть сделаны. Таким образом, для показанных здесь результатов кадры не были удалены. Однако, если артефакты движения существенно изменяют результаты, автоматизированные системы могут идентифицировать и корректировать кадры с артефактами движения^{1, 11}, или ослепленный наблюдатель может удалить такие кадры.

Введение аллилизотиоцианата вызывает кальций-ассоциированный нервный сигнал у личинок рыбок данио
Введение AITC (шаг 2.6) вызывает значительное увеличение GCaMP6s-ассоциированной нейронной активности в головном мозге личинки ^{данио-рерио ...}

Мы показали, что нейронная активность может быть зарегистрирована в мозге личинок данио-рерио с помощью GCaMP6s в сочетании с конфокальной микроскопией; более низкая скорость захвата, необходимая из-за более медленной кинетики GCaMP, может быть компенсирована уменьшением ...

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Эта работа была поддержана грантом ACR от Национальных институтов здравоохранения (SC2GM1304854) и грантом DLG от Национального научного фонда (2050850).