JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لفحص النشاط العصبي في مناطق الدماغ لأسماك الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن مؤشرات الكالسيوم GCaMP باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر.

Abstract

يرقات الزرد هي نظام نموذج فقاري واعد لدراسة الآليات العصبية للسلوك. تسهل شفافيتها والدوائر العصبية البسيطة نسبيا استخدام تقنيات البصريات الوراثية في التحليلات الخلوية للسلوك. تم استخدام مؤشرات الفلورسنت للنشاط العصبي في الجسم الحي ، مثل GCaMP6s ، على نطاق واسع لدراسة النشاط العصبي المرتبط بالسلوكيات البسيطة في يرقات الزرد. هنا ، نقدم بروتوكولا للكشف عن النشاط المستحث عن النشاط الحسي في يرقات الزرد شبه المقيدة باستخدام الخط المعدل وراثيا Tg (elav3: GCaMP6s). على وجه الخصوص ، نستخدم العامل الكيميائي أليل إيزوثيوسيانات للحث على استجابة فلورية قوية وقابلة للتكرار في منطقة الدماغ عند حدود الدماغ الخلفي والحبل الشوكي. نناقش الاستخدامات المحتملة ل GCaMP6s للمراقبة البصرية للنشاط العصبي خلال مجموعة من النماذج السلوكية وقيود هذه التقنية. يحدد بروتوكولنا نهجا يمكن الوصول إليه لمراقبة النشاط العصبي الديناميكي المرتبط بالسلوك في الجسم الحي في دماغ الزرد اليرقي.

Introduction

تمثل أسماك الزرد نموذجا حيوانيا للفقاريات مع قابلية للتتبع للتحقيقات العصبية البيولوجية الخلوية الجزيئية التفصيلية. تمتلك الزرد اليرقي ~ 100,000 خلية عصبية بعد 5 أيام من الإخصاب (DPF) ، وهو أقل بكثير من أدمغة الثدييات. علاوة على ذلك ، فإن أسماك الزرد شفافة نسبيا ، وهي خاصية تسهل الدراسات البصرية للبنية العصبية والوظيفة1،2،3،4،5. تم تطوير العديد من أدوات البصريات الوراثية للاستخدام في أسماك الزرد ، بما في ذلك مؤشرات الكالسيوم عاليةالدقة 6 ، وأجهزة استشعار الجهد7،8 ، وعلامات النشاط العصبي المعتمدةعلى النشاط 9،10،11،12،13. هذه الأدوات مكملة للمزايا الأخرى التي يمتلكها هذا النموذج ، مثل الملاءمة للتعديلات الجينية14،15،16،17 والاستعداد الذي تمتص به يرقات سمك الزرد المواد الكيميائية الموجودة في محاليلالاستحمام 18،19،20،21.

مجموعة متنوعة من الطرق مفيدة لفسيولوجيا بصرية لسمك الزرد ، وخاصة الفوتون ثنائي الفوتون ، والصفيحة الضوئية ، والفحص المجهري متحد البؤر. يجب أن توازن كل من هذه التقنيات بين مشكلتين مرتبطتين بالدقة: الوصول البصري ، بما في ذلك تشتت الضوء بواسطة الأنسجة المحيطة ، وسرعة أخذ العينات ، خاصة لالتقاط حركية جهد الفعل على مقياس أقل من المليثانية 22. كانت هناك تحسينات كبيرة في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي باستخدام الفحص المجهري ثنائي الفوتون ، ولكن غالبا ما تقتصر هذه الطريقة على مجال رؤية يبلغ <1 مم2 ، وعادة ما يمكن الحصول على مستوى واحد فقط من العمق ، مما يحد من التقاط النشاط عبر مناطق كبيرة من الدوائر العصبية22. بالنسبة للفحص المجهري للورقة الضوئية ، فإن إمكانية تسجيل نشاط جميع الخلايا العصبية تقريبا في الدماغ تحل قيود مجال الرؤية للفحص المجهري ثنائي الفوتون ، لكن سرعات الكاميرا الحالية تحد فعليا من التقاط ما يقرب من ثلاثة أحجام دماغية في الثانية عند 40 مستوى لكل حجم دماغي في يرقات الزرد1،23. الفحص المجهري متحد البؤر أدنى من دقة العمق وسرعة الالتقاط من الفحص المجهري ثنائي الفوتون والصفيحة الخفيفة. يتميز الفحص المجهري متحد البؤر بمزايا إمكانية الوصول على نطاق واسع إلى المختبرات في جميع أنحاء العالم والقدرة على تحقيق إعادة بناء الدماغ بالكامل للنشاط العصبي باستخدام مراسلي النشاط العصبي ، مثل cFos و p-ERK9. علاوة على ذلك ، إذا تم استهداف مناطق دماغية صغيرة ، يمكن أن يوفر المجهر متحد البؤر حلا زمنيا مناسبا للنشاط العصبي.

تصف هذه الورقة طريقة تستخدم الفحص المجهري متحد البؤر لتسجيل النشاط العصبي في أسماك الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن GCaMP6s عموما للخلايا العصبية. تم تطوير العديد من البروتوكولات المماثلة باستخدام يرقات الزرد لفهم وظيفة المسارات العصبية24،25،26،27،28،29. تم دمج السمات الرئيسية للعديد من هذه البروتوكولات ، مثل التصوير بفاصل زمني ، ومؤشرات الفلورسنت لديناميكيات الكالسيوم ، والتصوير الحي ، لقياس النشاط العصبي في مجموعة صغيرة من الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي لأسماك الزرد استجابة للأليل إيزوثيوسيانات (AITC) ، وهو مادة كيميائية مهيجة11،26،27،29،30،31. يثير AITC استجابة على مستوى الدماغ تركز على منطقة الدماغالخلفي 11. مجموعة واحدة من الخلايا العصبية الذيلية للدماغ الخلفي لها دور في الحركة واستجابة طويلة الأمد ل AITC. هذه الاستجابة تدوم أكثر من إزالة الحافز المكروض30. من خلال تقييد مجال الرؤية ، نجحنا في اكتشاف النشاط العصبي في هذه المجموعة العصبية كما ينعكس في التغير الفلوري في الخلايا العصبية التي تعبر عن GCaMP6s. نحن نقدم التقنيات والمبادئ التوجيهية وأفضل الممارسات لتحقيق دقة زمانية مكانية كافية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. بالإضافة إلى ذلك ، نناقش قيود طريقة التسجيل البصري الخاصة بنا. على الرغم من هذه القيود ، يجب أن تسمح الطريقة بالتحقيق في مجموعة متنوعة من الظواهر العصبية الحيوية ، بما في ذلك الذاكرة والمعالجة الحسية الحركية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تستخدم من قبل لجنة استخدام رعاية المؤسسية في جامعة ولاية كاليفورنيا ، فولرتون (البروتوكول # 2023-1310).

1. تنظيم يرقات الزرد في الاغاروز منخفض نقطة الانصهار

  1. تربية البالغة المعدلة وراثيا من Tg (elav3: GCaMP6s) 6 مع ذكرين إلى أنثى وفقا للإرشادات المؤسسية لرعاية. يتم وضع البالغين في غرف تكاثر خاصة بحيث يتم التقاط البيض الذي تم إطلاقه في غرفة سفلية ذات قاع زائف لا يمكن للبالغين الوصول إليه. في الضوء الأول أو عند إزالة مقسم الفصل ، تطلق الإناث البيض ، ويقوم الذكور بتخصيب البيض الذي تم التقاطه في القاع الزائف.
  2. قم بإزالة البالغين وجمع البويضات المخصبة باستخدام مصفاة البيض وضعها في وسط الجنين (E3) (5 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.33 ملي مجم كلوريد الكلوريد 4 ، 0.33 ملي كالسيكلوريد 2 ، 0.17 ملي كلوريد كولوريد ، 1 ملي هيبس ، 0.00001٪ ميثيلين أزرق ، درجة الحموضة 7.0) 30 مع 14 ساعة ضوء / 10 ساعات داكن عند 28.5 درجة مئوية داخل حاضنة داخل حاضنة
    ملاحظة: تحتوي وصفة E3 المستخدمة على تركيز منخفض من أزرق الميثيلين الذي لا يؤثر على التألق أو يؤدي إلى أي إشارة مضان تلقائي مهمة. لا نطلب استخدام 1-phenyl 2-thiourea (PTU) في الأعمار التنموية المحددة في البروتوكول بسبب الشفافية الطبيعية التي يوفرها الخط المعدل وراثيا GCaMP6s.
  3. جبل بعد 2-7 أيام من الإخصاب (dpf) باستخدام 3٪ من الاغاروز نقطة انصهار منخفضة مذاب في وسط E3. قم بتسخين agarose إلى درجة حرارة يمكن عندها التلاعب بسمك الزرد دون الإضرار بالكائن الحي. قبل أن تبرد نقطة الانصهار المنخفضة وتصلب (<1 دقيقة) ، ضع الجانب الظهري لليرقات لأعلى في طبق بتري بقاع زجاجي بحيث تكون منطقة الدماغ المراد فحصها قريبة من الهدف قدر الإمكان ، كما هو موضح في الشكل 1. اعتمادا على التجربة ، عادة ما يكون 8 إلى 10 أسماك زرد لكل مجموعة تجريبية كافية.
    ملاحظة: لم يتم تخدير في هذا البروتوكول.
  4. بعد أن يتماسك الاغاروز مع وضع اليرقة في مكانها (حوالي 2 إلى 3 دقائق) ، أضف 5 مل من محلول E3. ثم قم بقطع الاغاروز بمشرط كما هو مطلوب في البروتوكول التجريبي.
    ملاحظة: يجب قطع أجزاء مختلفة من الأجار ، اعتمادا على أجزاء من أسماك الزرد التي تحتاج إلى تحريرها من ضبط النفس و / أو تلقي نوع مختلف من التحفيز.
  5. انقل طبق بتري الذي يحتوي على سمكة الزرد إلى مرحلة المجهر متحد البؤر واترك الأسماك تتأقلم لمدة 20 دقيقة.

2. الإعداد والتصوير تحت الفحص المجهري متحد البؤر مع تطبيق التحفيز

  1. بعد فترة التأقلم ، قم بتوسيط الأسماك تحت هدف الغمر في الماء 40x (NA 1.0) في درجة حرارة الغرفة باستخدام حقل ساطع بمصدر ضوء (~ 475 نانومتر).
  2. تعتمد إعدادات الحصول على المجهر متحد البؤر على صفات جزيء الفلورسنت ومستوى تعبيره ، والعمق والخصائص البصرية للأنسجة ، وحجم مجال الرؤية ، وسرعة التسجيل. حدد الإعدادات المناسبة باستخدام مؤشر النطاق لضمان التقاط الضوء المنبعث بشكل مثالي وفقا للاحتياجات التجريبية.
  3. تأكد من الضبط المناسب لقوة الليزر والكسب الرئيسي لالتقاط ضوء الفلورسنت في النطاق الأمثل ، وبالتالي منع الفقدان غير الضروري لإشارة التألق المعتمدة على GCaMP6s. استخدم قائمة الإعدادات والعوامل البؤرية الرئيسية الواردة أدناه لتحديد الإعدادات المناسبة.
    1. حجم الثقب: حدد ذلك من خلال الهدف المستخدم وتعيينه لقبول مستوى بؤري واحد مع تقييد المستويات البؤرية الأخرى. بالنسبة لهذا البروتوكول ، يتم استخدام ثقب بحجم 32 ميكرومتر.
    2. قوة الليزر والطول الموجي: اضبط قوة الليزر بناء على مستوى التعبير عن جزيء الفلورسنت والعمق والخصائص البصرية للأنسجة. استخدم مؤشر النطاق للتأكد من أن الليزر لا يتجاوز نطاق الكاشف الضوئي. اضبط الطول الموجي للإثارة على الطول الموجي للضوء الذي يثير جزيء الفلورسنت على النحو الأمثل. بالنسبة لهذه التجربة ، نظرا لأن الأسماك كانت متغايرة الزيجوت بالنسبة للجين المعدل GCaMP6s وكانت مستويات التعبير منخفضة ، استخدم طاقة ليزر بنسبة 5٪ بطول موجي 488 نانومتر ، 650 كسب رئيسي. مع التعبير القوي للجينات المعدلة ، تتراوح قوة الليزر من 1.5٪ إلى 3٪ ، وهو ما يكفي عادة.
      ملاحظة: إذا تم ضبط طاقة الليزر على مستوى منخفض جدا ، فقد المعلومات (الضوء الذي تم اكتشافه بواسطة أنبوب المضاعف الضوئي). إذا تم ضبط طاقة الليزر على مستوى عال جدا ، فقد يتجاوز الضوء المنبعث نطاق الكاشف أو يتلف العينة (التبييض الضوئي).
    3. الكسب الرئيسي: يحدد الكسب الرئيسي حساسية كاشف الضوء. استخدم مؤشر النطاق لضمان عدم ضبط الكسب الرئيسي على ارتفاع كبير ، وبالتالي تجاوز نطاق كاشف الضوء. بالنسبة لهذه التجربة، يتم تعيين الكسب الرئيسي على 650.
    4. مجال الرؤية: تأكد من أن مجال الرؤية كبير بما يكفي لالتقاط الأنسجة ذات الاهتمام. يعد هذا قيدا رئيسيا للمجاهر متحد البؤر بشكل عام لأن حجم مجال الرؤية سيحد من سرعة الالتقاط ، كما هو موضح في الشكل 2. بالنسبة للتجارب التي تنطوي على AITC ، اضبط مجال الرؤية على 79.86 ميكرومتر2.
    5. سرعة الالتقاط: مع زيادة سرعة الالتقاط ، سيتم تقليل كمية الضوء التي يلتقطها كاشف الضوء. مع التقاط ضوء أقل ، ستتدهور جودة الصورة. تأكد من أن سرعة الالتقاط توازن بين جودة الصورة والسرعة المطلوبة لالتقاط الحدث الفسيولوجي المثير للاهتمام. هنا ، يتم ضبط سرعة الالتقاط على 1.20 f / s.
  4. توسيط مجال الرؤية على ذيلية عنقودية عصبية إلى commissura infima Halleri في الجزء المنقاري من البلالشوكي 30. هذه المجموعة صغيرة جدا عند ~ 2.5 dpf ولكنها أكبر بكثير في وقت لاحق من التطوير (7 dpf).
    ملاحظة: إذا كان تركيب الاغاروز في الخطوة 1 دون المستوى الأمثل ، أي أن تم وضعه بزاوية أو بعمق شديد في الاغاروز ، فستتأثر جودة الصورة سلبا. تظهر صورة للحبل الشوكي لسمك الزرد في في وضع جيد وصورة متناقضة للحبل الشوكي في سمكة الزرد الموضوعة بشكل غير مثالي في الشكل 3.
  5. قم بإجراء مسح ضوئي للسلاسل الزمنية باستخدام مجال رؤية 79.86 ميكرومترمربع بمعدل 1.20 إطارا لكل ثانية (fps) بدقة مكانية تبلغ 0.119 ميكرومتر2 لكل بكسل. اضبط حجم مجال الرؤية وسرعة الحصول على الصورة وفقا للتطبيق المطلوب.
  6. بعد دقيقتين من بدء التصوير ، أضف 41.67 ميكرولتر من محلول مخزون AITC (تركيز نهائي 10 ميكرومتر) أو محلول E3 إلى الطبق باستخدام ماصة. استمر في التسجيل لمدة ~ 30 ثانية لملاحظة أي تغييرات في نشاط GCaMP6s في المنطقة ذات الاهتمام باستخدام التصوير بفاصل زمني. بعد اكتمال التسجيل ، حرر من الاغاروز وقم بالقتل الرحيم وفقا لإرشادات رعاية المؤسسية.
    ملاحظة: أثناء تسجيل نشاط GCaMP6s ، يمكن أن يكون الضوء متحد البؤر نفسه محفزا. يجب مراعاة ذلك في تحليل نتائج التصوير. وقت التسجيل هو دالة لعدد الإطارات ومعدل التقاط كل إطار ، والذي يمكن تعديله حسب الضرورة للوقت المطلوب.

3. تحليل إشارة GCaMP باستخدام فيجي

  1. بعد التسجيل ، إذا لم يكن الإخراج بتنسيق الملف .tif لتحليل FIJI المصب ، فقم بتصدير ملفات الصور كملفات .tif من مجموعة برامج المجهر.
  2. قم بتنزيل FIJI لتحليل الآثار العصبية. افتح FIJI ، واستورد ملفات .czi إلى البرنامج ، وعندما يطلب منك ذلك ، استخدم الإعدادات الافتراضية في المكون الإضافي BioFormats.
  3. قم بتمييز منطقة / خلايا عصبية ذات أهمية باستخدام أدوات الدائرة أو الأدوات اليدوية من خلال النقر على الرموز الخاصة بها. (سيؤدي التمرير فوق الرموز إلى وميض اسم الأداة في البرنامج.)
    ملاحظة: نظرا لاختلاف منطقة الاهتمام في الحجم ، لا يمكن استخدام المناطق / الدوائر الثابتة. يمكن للبرامج التي تسمح بتسجيل التغيرات الفلورية بمرور الوقت مثل voxels ، مثل حزمة Thunder32 ، أن تسمح باكتشاف الخلايا العصبية الفردية. ومع ذلك ، بالنسبة للخلايا العصبية ~ 20 في التجربة الحالية ، من المرجح أن يكون اكتشاف حدود الغشاء من قبل مراقب أعمى متفوقا على نظام الكشف الآلي.
  4. بعد تحديد عائد الاستثمار، في شريط أدوات FIJI، انقر فوق تحليل أدوات > > مدير العائد على الاستثمار. بعد ذلك ، انقر فوق إضافة [t] ، وستتم إضافة عائد الاستثمار المحدد إلى نافذة مدير عائد الاستثمار.
  5. ضمن مدير عائد الاستثمار، انقر على المزيد > القياس المتعدد. اترك الإعدادات في الوضع الافتراضي وانقر فوق موافق. ستنتج FIJI بيانات أولية يمكن معالجتها كملف CSV باستخدام Python أو كبيانات أولية في جدول بيانات.
  6. لتطبيع البيانات الأولية وتمثيلها كتتبع عصبي لمنطقة معينة ذات أهمية ، قم بحساب متوسط قيم آخر ~ 30 ثانية لنافذة 2 دقيقة قبل التحفيز ، وتطبيع جميع قيم ما بعد التحفيز إلى متوسط قيمة خط الأساس:
    شدة التألق الطبيعي = (التألق الفوري لمنطقة معينة ذات أهمية بعد التحفيز) / (متوسط التألق ~ 30 ثانية من فاصل 2 دقيقة قبل التحفيز)
  7. ارسم البيانات كآثار عصبية ، كما هو موضح في الشكل 4.
    ملاحظة: في بعض أنواع النسخ المجهرية ، مثل الفحص المجهري للورقة الضوئية ، حيث يتم تسجيل حجم من الدماغ ، تتم معالجة القطع الأثرية للحركة عبر التسجيل المكاني بعد المعالجة إلى حجم الدماغ المرجعي1،11. ومع ذلك ، نظرا لأننا نسجل فقط من مستوى واحد ، فلا يمكن إجراء أي تعديلات على القطع الأثرية للحركة. لذلك ، بالنسبة للنتائج الموضحة هنا ، لم تتم إزالة أي إطارات. ومع ذلك ، إذا غيرت القطع الأثرية للحركة النتائج بشكل كبير ، يمكن للأنظمة الآلية تحديد وتصحيح الإطارات باستخدام القطع الأثرية للحركة1 ، 11 ، أو يمكن للمراقب الأعمى إزالة مثل هذه الإطارات.

النتائج

يؤدي إعطاء أليل إيزوثيوسيانات إلى ظهور إشارة عصبية مرتبطة بالكالسيوم في يرقات أسماك الزرد
تسبب إدارة AITC (الخطوة 2.6) زيادة واسعة النطاق في النشاط العصبي المرتبط ب GCaMP6s عبر دماغ يرقات الزرد11،30. لاحظنا زيادة في إشارة الفلورسنت في م...

Discussion

لقد أظهرنا أنه يمكن تسجيل النشاط العصبي في أدمغة يرقات الزرد باستخدام GCaMP6s جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري متحد البؤر. يمكن تعويض سرعات الالتقاط المنخفضة المطلوبة بسبب حركية GCaMPs البطيئة عن طريق تقليل منطقة الدماغ التي لوحظت6. يتوفر مراسلون يتمتعون بديناميكيا?...

Disclosures

ويعلن المؤلفون أن البحث أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل بمنحة إلى ACR من المعاهد الوطنية للصحة (SC2GM1304854) ومنحة إلى DLG من المؤسسة الوطنية للعلوم (2050850).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Low Melting Point AgaroseInvitrogen16520-100Diluted to 3%
Allyl Isothiocyanate (AITC)Sigma Aldrich377430Chemical stimulant
E3N/AN/AWater-medium for zebrafish larvae
Glass Bottom DishesThermo Fisher Scientific12-567-400Used to hold zebrafish during imaging experiments
Micropipette (10-100 uL)Cole-Parmer21600-14Apparatus used for creating AITC dilutions
Microscope SlidesFisherbrand12-550-A3Used to screen for phenotype
Mirror Finish ForcepsDUMONT11251-23Used to orient zebrafish in agarose
myTEMP Mini Digital IncubatorsBenchmarkH2200-HCHolding area for zebrafish; set to 28.5°C
Nitrile GlovesMedPRIDEMPR-50504Basic PPE
Petri DishesVWR89107-632Container for zebrafish
Posi-Click TubesDENVILLEC-2171Used for AITC dilution
Samco Polyurethane Transfer PipettesThermo Fisher Scientific225Apparatus used to select animal/administer diluted bolus of AITC
Stemi SV11 Apo MicroscopeZeiss1.25496E+11Used to stage zebrafish
Transgenic Larval Zebrafish (2 to 7 DPF)N/AN/AAnimal test subjects; Tg(elav3:GCaMP6s) strain
Zeiss Confocal Microscope (Model LSM9)Zeiss3523004097Imaging of fish

References

  1. Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy. Nat Method. 10 (5), 413-420 (2013).
  2. Meyer, M. P., Smith, S. J. Evidence from in vivo imaging that synaptogenesis guides the growth and branching of axonal arbors by two distinct mechanisms. J Neurosci. 26 (13), 3604-3614 (2006).
  3. Sagasti, A., Guido, M. R., Raible, D. W., Schier, A. F. Repulsive interactions shape the morphologies and functional arrangement of zebrafish peripheral sensory arbors. Curr Biol. 15 (9), 804-814 (2005).
  4. Son, J. H., et al. Transgenic FingRs for live mapping of synaptic dynamics in genetically-defined neurons. Sci Rep. 6, 18734 (2016).
  5. Zada, D., Tovin, A., Lerer-Goldshtein, T., Vatine, G. D., Appelbaum, L. Altered behavioral performance and live imaging of circuit-specific neural deficiencies in a zebrafish model for psychomotor retardation. PLoS Genet. 10 (9), e1004615 (2014).
  6. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  7. Abdelfattah, A. S., et al. and photostable chemigenetic indicators for extended in vivo voltage imaging. Science. 365 (6454), 699-704 (2019).
  8. Abdelfattah, A. S., et al. Sensitivity optimization of a rhodopsin-based fluorescent voltage indicator. Neuron. 111 (10), 1547-1563.e9 (2023).
  9. Gao, Y. J., Ji, R. R. c-Fos and pERK, which is a better marker for neuronal activation and central sensitization after noxious stimulation and tissue injury. Open Pain J. 2, 11-17 (2009).
  10. Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Front Neural Circuits. 8, 37 (2014).
  11. Randlett, O., et al. Whole-brain activity mapping onto a zebrafish brain atlas. Nat Methods. 12, 1039-1046 (2015).
  12. Reijmers, L. G., Perkins, B. L., Matsuo, N., Mayford, M. Localization of a stable neural correlate of associative memory. Science. 317 (5842), 1230-1233 (2007).
  13. Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins. Nature Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).
  14. Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
  15. Wyart, C., Del Bene, F. Let there be light: zebrafish neurobiology and the optogenetic revolution. Rev Neurosci. 22 (1), 121-130 (2011).
  16. Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons. Curr Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).
  17. Portugues, R., Severi, K. E., Wyart, C., Ahrens, M. B. Optogenetics in a transparent animal: circuit function in the larval zebrafish. Curr Opinion Neurobiol. 23 (1), 119-126 (2013).
  18. Best, J. D., Alderton, W. K. Zebrafish: An in vivo. model for the study of neurological diseases. Neuropsychiat Dis Treatment. 4 (3), 567-576 (2008).
  19. Goldsmith, P. Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when. Curr Opinion Pharmacol. 4 (5), 504-512 (2004).
  20. Roberts, A. C., et al. Habituation of the C-start response in larval zebrafish exhibits several distinct phases and sensitivity to NMDA receptor blockade. PloS One. 6 (12), e29132 (2011).
  21. Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15468-15473 (2011).
  22. Ji, N., Freeman, J., Smith, S. L. Technologies for imaging neural activity in large volumes. Nat Neurosci. 19 (9), 1154-1164 (2016).
  23. Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using selective plane illumination microscopy. Front Neural Circuits. 7, 65 (2013).
  24. Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. CSH Protoc. 2007, (2007).
  25. Liu, T. T., Hou, H., Du, J. L. A protocol for simultaneous Ca2+ and morphology imaging of brain endothelial tip cells in larval zebrafish. STAR Protoc. 2 (1), 100388 (2021).
  26. Wong, H. C., Drerup, C. M. Using fluorescent indicators for in vivo quantification of spontaneous or evoked motor neuron presynaptic activity in transgenic zebrafish. STAR Protoc. 3 (4), 101766 (2022).
  27. Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. J Vis Exp. (26), e1217 (2009).
  28. Hirsinger, E., Steventon, B. A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development. J Vis Exp. (119), e55210 (2017).
  29. Renaud, O., Herbomel, P., Kissa, K. Studying cell behavior in whole zebrafish embryos by confocal live imaging: application to hematopoietic stem cells. Nat Protoc. 6 (12), 1897-1904 (2011).
  30. Roberts, A. C., et al. Induction of short-term sensitization by an aversive chemical stimulus in zebrafish larvae. eNeuro. 7 (6), (2020).
  31. Prober, D. A., et al. Zebrafish TRPA1 channels are required for chemosensation but not for thermosensation or mechanosensory hair cell function. J Neurosci. 28 (40), 10102-10110 (2008).
  32. Freeman, J., et al. Mapping brain activity at scale with cluster computing. Nat Methods. 11, 941-950 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

218

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved