Dişi Yumurtalıklı Farelerde İnsan Meme Kanseri Ksenogreftlerinde Östrojen Reseptörü α Ekspresyonunu Görselleştirmek için 16α-[18F]-Floro-17β-Estradiol PET Kullanımı

Burada, ERα-pozitif meme ksenogreftlerinde ERα ekspresyonunu görselleştirmek için bir araç olarak 16α-[18F]-floro-17β-estradiol (¹⁸F-FES) pozitron emisyon tomografisi (PET) kullanmak için bir protokol gösteriyoruz.

Östrojen reseptörü alfa (ERα) pozitif meme kanseri ksenogreftlerinin 16α-[18F]-floro-17β-estradiol (¹⁸F-FES) pozitron emisyon tomografisi (PET) kullanılarak BALB/c çıplak farelerde nasıl görselleştirilebileceğini göstermek için, yumurtalıklı BALB/c çıplak farelere ERα pozitif meme kanseri hücreleri (MCF-7, 3 × 10⁶ hücre; omuz [n = 10] veya 4^{. kasık} meme yağ yastığı [n = 10]) veya ERα-negatif meme kanseri hücreleri (MDA-MB-231, 1 × 10⁶ hücre; meme yağ yastığı [n = 5]). MCF-7 hücrelerini barındıran farelere, hücre enjeksiyonundan 2 gün önce enselerine 20 μg 17β-estradiol (20 μg/20 μL; mısır yağı: etanol, 9:1) deri altı enjeksiyonları yapıldı, ardından 5 hafta boyunca haftada beş kez günlük enjeksiyonlar yapıldı. Tümör hacimleri aşağıdaki formüle göre ölçüldü: (L * W²) / 2 (L; uzunluk, W; genişlik). Tümör hacimleri yaklaşık 100 mm'ye^{ulaştığında 3}, ERα ile rekabetçi bağlanmayı önlemek için PET görüntüleme için 18 F-FES alan farelerden 2 gün önce 17β-estradiol enjeksiyonları durduruldu. Lateral kuyruk veni yoluyla ¹⁸F-FES uygulandıktan sonra, enjeksiyondan 1 saat ila 1.5 saat sonra 15 dakika boyunca PET/MRG yapıldı. ¹⁸ERα negatif, MDA-MB-231 tümör taşıyan farelerde F-FES tutulumu gözlenmedi. ¹⁸F-FES alımı en çok omuzda MCF-7 tümörleri barındıran farelerde belirgindi. Kasık meme yağ yastığında büyüyen MCF-7 tümörlerinde, ¹⁸F-FES'in bağırsak atılım paterni bu tümörlerde tespit edilebilen radyoaktiviteyi gizlediğinden, ¹⁸F-FES alımı daha az görünürdü. ¹⁸F-FES PET'i ERα pozitif meme ksenogreftlerinde ERα ekspresyonunu görselleştirmek için bir araç olarak kullanmak için, omuz gibi farelerin abdominal bölgesinden uzakta bulunan tümörlerde ¹⁸F-FES tutulumunun görünürlüğünün net olduğunu gösterdik.

Meme kanserleri (BC) farklı moleküler alt tiplere ayrılabilir¹. Luminal alt tip olarak sınıflandırılan meme tümörleri, östrojen reseptörü alfa'yı (ERα) aşırı eksprese eder. Bu nedenle, BC'nin bu alt tipi aynı zamanda ERα-pozitif (ERα⁺) olarak da adlandırılır. Neyse ki, ERα⁺ BC teşhisi konanlar, düşük uzak metastaz oranları ile birlikte en yüksek 10 yıllık sağkalımı yaşarlar ^2,3. ERα ekspresyonu nedeniyle, bu tür hastalar seçici östrojen reseptör modülatörleri (SERM'ler), anti-östrojen ilaçları ve aromataz inhibitörleri⁴ dahil olmak üzere bir dizi hormon tedavisi seçeneğine erişebilir.

Bir meme kanseri hastasının hormon tedavisi için uygun olup olmadığını değerlendirmek için, meme tümörleri içindeki ERα ekspresyon seviyeleri belirlenmelidir ^5,6,7. Testlerin altın standardı immünohistokimya (IHC) yöntemleri kullanılarak yapılırken, birçok rapor elde edilen sonuçların hem tekrarlanabilirliği hem de güvenilirliği konusunu vurgulamaktadır ^6,8,9. IHC, tekniğin doğası gereği yarı kantitatif olması nedeniyle sonuç uyumsuzluğuna yol açabilir, burada doku işleme ve müteakip yorumlamadaki farklılıklar değişkenliğe yol açabilir⁶. Bu tekrarlayan sorunu düzeltmek için, gözlemciler arası varyasyonu azaltmak amacıyla Amerikan Klinik Onkoloji Derneği tarafından 2010 yılında kılavuzlar belirlendi^{ve 2020'de güncellendi 10}. Şu anda, klinik olarak doğrulanmış kesme %≥1'dir ve ERα ekspresyonu çok küçük ekspresyon seviyelerinde bile endokrin tedavisi kullanılarak klinik olarak anlamlı faydalar göstermektedir¹¹.

İleri BC'de, ERα ekspresyonu metastazlar ve primer tümör arasında farklılık gösterebilir. Bazı gözlemler, metastatik lezyonlar ile primer tümör arasında ERα ekspresyon seviyelerinde %18-55'lik bir tutarsızlık olduğunu bildirmektedir ve bu da BC metastazlarının ERα durumunun belirlenmesinin önemine işaret etmektedir¹². Bunu ele almak için kılavuzlar, bilinçli tedavi planları yapmak için metastatik lezyonlarda hormon reseptör durumunu doğrulamanın önemini vurgulamaktadır^13,14. Bununla birlikte, bunun fizibilitesi, özellikle IHC yöntemleriyle, biyopsi alınmasının zor olduğu yerlerde metastazların olabileceği göz önüne alındığında tartışmalıdır.

Moleküler görüntüleme yöntemleri, kanser hastalarında tümör lezyonlarının tespiti ve görselleştirilmesi için temel araçlar haline gelmiştir. Özellikle, pozitron emisyon tomografisi (PET) görüntüleme, bu lezyonları non-invaziv olarak görselleştirmek amacıyla tümörlerin belirli özelliklerinden yararlanmak için tasarlanmış izleyicilerin veya daha spesifik olarak radyofarmasötiklerin kullanılmasını gerektirir. Onkolojide kullanılan en yaygın PET izleyici ¹⁸F-florodeoksiglukozdur (¹⁸F-FDG)¹⁵. Bu çalışmada, radyoaktif işaretli bir estradiol formu olan ¹⁸F-floroestradiolün (¹⁸F-FES) kullanımını araştırıyoruz. Estradiol - ERα için bir ligand - ağırlıklı olarak dişilerde yumurtalıklar tarafından üretilen bir hormondur¹⁶. ¹⁸F-FES, Gıda ve İlaç Dairesi'nden (FDA) yakın zamanda onay aldı ve Cerianna^TM olarak pazarlanıyor. Bu görüntüleme ajanı, tekrarlayan veya metastatik BC¹⁷ olan hastalarda biyopsilere yardımcı olarak kullanılmak üzere tasarlanmıştır. ¹⁸F-FES ile tüm vücut PET görüntüleme, hem primer tümörde hem de biyopsi almanın zor olduğu bölgelerdeki uzak metastazlarda ERα seviyelerini tespit etmek için non-invaziv bir yöntem olarak kullanılabilir¹⁸. ¹⁸F-FES PET görüntüleme kullanılarak ERα seviyelerinin tahmini, IHC sonuçları ile ilişkilidir ve ayrıca, ¹⁸F-FES PET görüntüleme kullanılarak ERα'nın çok az saptanması veya hiç saptanmaması, hormon tedavisine yanıt verme olasılığı düşük olan tümörlerin güvenilir bir belirleyicisidir¹⁸. ^{Klinikte 18}F-FES'in uygun kullanımını sağlamak için, alanında uzman kişiler tarafından fikir birliği ile kılavuzlar formüle edilmiştir¹⁹. Bu çalışmada, farelerde meme kanserinin klinik öncesi modellerinde ¹⁸F-FES PET kullanımını değerlendiriyoruz.

Tüm hayvan çalışmaları, Austin Hastanesi Hayvan Etik Komitesi (A2023/05812) tarafından onaylanmıştır ve hayvanların bilimsel amaçlarla bakımı ve kullanımı için Avustralya Yasasına uygun olarak yürütülmüştür.

1. Hücre hazırlığı

1. Rutin hücre kültürü prosedürlerini kullanarak, MDA-MB-231 ve MCF-7 hücrelerini, penisilin / streptomisin ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş DMEM / F-12'de T175 doku kültürü şişelerinde tutun. Hücreleri enjeksiyon için hazırlamadan önce, sıvı nitrojen depolarından canlanmayı takiben hücreleri en az 3 kez geçirin. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO₂ ile büyütün.
2. Hücrelerin enjeksiyon için hazırlandığı gün, 15 fare için fare başına enjeksiyon başına 3 ×^{10 6} MCF-7 hücresi olacak şekilde hücreleri çoğaltın (yani, en az 45 × 10⁶ MCF-7 hücresi) ve 5 fare için fare başına enjeksiyon başına 1 × 10⁶ MDA-MB-231 hücresi (yani, en az 5 × 10⁶ MDA-MB-231 hücre).
   NOT: Her farede eşit sayıda hücreye izin vermek için, beş ekstra enjeksiyon için yeterli hücre hazırlayın (örneğin, beş fareyi enjekte etmek için 10 enjeksiyon için yeterli hücre hazırlayın).
3. Hücre enjeksiyonu gününde, ortamı tüm şişelerden çıkarın ve hücre ayrılmasını kolaylaştırmak için hücrelere 1x fosfat tamponlu salin (PBS) (pH 7.4) içinde yaklaşık 5 mL tripsin-EDTA (% 0.25 tripsin ve% 0.05 EDTA) yerleştirin.
4. Hücreler ayrıldıktan sonra, tripsin aktivitesini inhibe etmek için şişelere yaklaşık 10 mL tam ortam yerleştirin. Hücreleri yeniden askıya alın ve tek hücreli süspansiyonu 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Pelet hücrelerine 2 dakika boyunca ~ 300 × g'da santrifüjleyin.
5. Hücre peletini uygun bir hacimde ortamda yeniden süspanse edin ve hasat edilen toplam hücre sayısını belirlemek için hücreleri sayın.
   NOT: mL başına yaklaşık 1 × 10⁶ hücreli çözeltileri saymayı hedefleyin (bir sayma odası kullanılıyorsa 50 kare başına 100-16 hücre). Tam şişe başına 5 × 10^6'da büyüyen hücreler için, hücreleri 5 mL ortamda hasat edin. Daha yüksek yoğunluklu hücre hatları için, şişe başına 10 mL ortam kullanın.
6. Bu adımı steril bir laminer akış kabininde buz üzerinde gerçekleştirin. Bu sayıya ulaşıldığında, hücre süspansiyonunu 300 × g'da 2 dakika boyunca pelet hücrelerine tekrar santrifüjleyin. Peleti soğuk PBS ve buz gibi soğuk bazal membran matris çözeltisinde, 3 × 10⁶ MCF-7 hücresi başına 40 μL PBS ve 10 μL bazal membran matris çözeltisi olacak şekilde yeniden süspanse edin.
7. MDA-MB-231 hücre peletini, 1 × 10⁶ hücre başına 40 μL PBS ve 10 μL bazal membran matris çözeltisi olacak şekilde aynı bileşenlerle yeniden süspanse edin. Hücre-PBS-bazal membran matris karışımını 50 mL'lik tüpten soğuk pipet ucu ile daha küçük 1,5 mL'lik tüplere aktarın ve hücre karışımını farelere hücre enjeksiyonundan hemen önce buz üzerinde tutun.
   NOT: Bu çalışmada kullanılan bazal membran matrisi -20 °C'de saklanmaktadır. Bazal membran matris çözeltisinin gerekli olmasından bir gün önce, çözeltinin bir kısmı gece boyunca çözülmek üzere 4 ° C'ye yerleştirilir. Ertesi gün soğuk havalarda (buz üzerinde) kullanıma hazırdır. Çözeltiyi pipetlerken, bazal membran matris çözeltisinin katılaşmasını önlemek için kullanılan pipet uçlarının soğuk olduğundan emin olun. Enjeksiyon için hücre hazırlığı gününden önce buzdolabında bir kutu steril pipet ucu bulundurmak iyi bir uygulamadır. Hücre peletini buz gibi soğuk PBS ve bazal membran matris çözeltisinde yeniden süspanse ederken, önce PBS eklenir, ardından gerekli miktarda bazal membran matris çözeltisi gelir.

2. Yumurtalıklı farelere hücre enjeksiyonu

1. 6-8 haftalık dişi yumurtalıklı BALB/c çıplak farelerin, hücre enjeksiyonundan en az 1 hafta önce hayvan barınma tesisinde iklimlendirmeye başlamasına izin verin.
   NOT: Bu çalışmanın daha yaşlı, 12-14 haftalık farelere erişimi vardı. Ovariektomi, düşük endojen estradiol seviyeleri sağlar ve ¹⁸F-FES ligandı ile rekabeti azaltır. İncelenen modele bağlı olarak, daha genç farelerin (ör., 4-8 hafta) daha düşük endojen estradiol^20,21 seviyeleri nedeniyle ovariektomi geçirmesi gerekmeyebilir.
2. Bir anestezi indüksiyon odası kullanarak% 4 izofluran ve 4 L / dk oranında oksijen içeren bir farede anesteziyi indükleyin. Fareyi gözlemleyin ve doğru refleks kaybı olup olmadığını kontrol edin. Artık hareket etmediklerinde, fareyi steril bir laminer akış kabinine aktarın, burnu burun maskesine yerleştirin ve izofluranı %2'ye ve oksijeni 2 L/dk oranına ayarlayarak anesteziyi sürdürün.
   NOT: Optimum bakımı sağlamak için her seferinde bir fareyi uyuşturun.
3. Meme içi yağ yastığı (IMF) enjeksiyonları için, cildi 4. kasık meme bezinin üzerinden alkolle sürün. Soğuk hücre süspansiyonunu çekmek için önceden soğutulmuş (buz üzerinde) 27 G'lik bir şırınga kullanın ve enjeksiyondan önce bazal membran matris çözeltisinin ısınmasını / katılaşmasını önlemek için şırıngayı buz üzerinde bırakın.
4. Baskın olmayan elin başparmağını ve işaret parmağını kullanarak, 4. meme bezini nazikçe kaldırın ve baskın el ile 27 G'lik bir şırınga iğnesi yerleştirin, iğnenin eğiminin yukarı baktığından emin olun. Hücre-PBS-bazal membran matris çözeltisi karışımını içeren 50 μL hücre süspansiyonunu meme yağ yastığına yavaşça enjekte edin.
   NOT: Hücreler enjekte edilirken parmaklar arasında bir kabarcık hissedilmelidir. Enjeksiyon bölgesinde herhangi bir sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
5. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, izofluranı kapatın ve oksijeni solumak ve bilinci yeniden kazanmak için farenin burnunu burun konisinde tutun (bu yaklaşık bir dakika sürmelidir). Optimum kurtarma için fareyi bir ısı yastığı üzerindeki bir kafese geri yerleştirin.
6. Omuz enjeksiyonları için, IMF enjeksiyonu için özetlenen yukarıdaki prosedürü kullanın, tek fark hücre enjeksiyonunun yeridir.
   NOT: Alternatif olarak, omuz enjeksiyonu anestezi olmadan tamamlanabilir (aşağıdaki adım 2.7'ye bakın).
7. Anestezi olmadan omuz enjeksiyonu için, baskın olmayan eli başparmak ve işaret parmağı arasında kullanarak cildi farenin omzunun üzerinden tutun ve kaldırın ve ciltte bir 'çadır' oluşturun. 27 G'lik bir şırınga iğnesi kullanarak hücre-PBS-bazal membran matris çözeltisini içeren 50 μL hücre süspansiyonunu yavaşça enjekte edin. İğneyi yavaşça çekin ve sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
   NOT: Alternatif olarak, hacim dağıtımının doğruluğunu sağlamak için küçük hacimli enjeksiyonlar için bir Hamilton şırınga kullanılabilir. Enjeksiyonlar arasında, farklı hücre hatları kullanılırken şırıngayı durulamak için% 80 v / v etanol kullanılır ve şırıngadan kalan etanolü durulamak ve çıkarmak için PBS kullanılır.

3. Estradiol çözeltisinin hazırlanması

1. Bir maddenin miligramını doğru bir şekilde ölçebilen bir ölçek kullanarak, 7 mg estradiol tozunu 1.5 mL'lik bir tüpe tartın.
2. 7 mg estradiol tozuna 700 μL %100 etanol ekleyin. 1.5 mL'lik tüpü oda sıcaklığında (RT) yaklaşık 1 saat veya estradiol tozu tamamen eriyene kadar yumuşak bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
3. Çözeltiyi, her biri 70 μL etanol-estradiol çözeltisi içeren on adet 1.5 mL tüp boyunca alikot edin. Tüpleri ileride kullanmak üzere -20 °C'ye yerleştirin.
   NOT: Estradiol-etanol stokları -20 °C'de yaklaşık 2 hafta tutulabilir.

4. Estradiol çözeltisinin deri altı enjeksiyonu

1. Estradiol enjeksiyonunun gerekli olduğu gün, aşağıdaki karışımı taze olarak hazırlayın. 630 μL mısır yağını, 70 μL etanol-estradiol çözeltisi içeren 1.5 mL'lik tüpe bir araç olarak birleştirin. Çözeltiyi homojen olana kadar vorteksleyin, etanolün ayrılmadığından ve araç yağının üstünde bir tabaka oluşturmadığından emin olun.
   NOT: Bu, 700 μL 20 μg/20 μL mısır yağı:etanol, 9:1 çözelti verir. Her fare bu çözeltiden 20 μL alır. Karışımdaki yağ, viskozitesi nedeniyle şırınganın dışına ve 1,5 mL'lik bir tüpün yanlarına yapışma eğiliminde olduğundan her zaman ekstra çözelti yapın (örneğin, 20 fare için, 400 μL yeterli olsa da, miktarı neredeyse iki katına çıkarmak (700 μL) hata için yeterli alan sağlar).
2. Bir insülin şırıngasına bağlı 29 G'lik bir iğne kullanarak, yavaşça 20 μL estradiol çözeltisi çekin.
   NOT: Çözelti 9 kısım yağ ila 1 kısım estradiol-etanol içerdiğinden, karışımın şırıngaya çekilmesi zaman alacaktır.
3. Estradiol çözeltisi enjekte edilecek fareler, ERα eksprese eden tümörleri barındıran ve bu nedenle büyümek için östrojene güvenen farelerdir (bu çalışmada MCF-7). ERα (bu çalışmada MDA-MB-231) eksprese etmeyen tümörleri barındıran farelere estradiol çözeltisi verilmez. Kısıtlama sırasında uzuvlarının incinmesini önlemek için enjekte edilecek fareyi öne, tercihen bir havluya nazikçe yerleştirin.
4. Baskın olmayan eli kullanarak, kuyruğunun üst kısmını yüzük ve küçük parmak arasında tutarak fareyi kısıtlayın. Estradiol çözeltisinin deri altı enjeksiyonu için deride bir 'çadır' oluşturmak üzere farenin boynuna yakın gevşek cildi kaldırmak için başparmak ve işaret parmağını kullanın.
5. Fareyi bu kısıtlamada tutarken, fareye estradiol solüsyonu enjekte etmek için baskın elinizi kullanın. İğnenin eğimi yukarı bakacak şekilde, iğnenin yarısından azı görünene kadar iğneyi cildin 'çadırının' altına itin.
   NOT: Solüsyon enjekte edilirken cilt gözle görülür şekilde balonlaşmalıdır.
6. Solüsyonun herhangi bir geri akışını önlemek için, iğneyi birkaç saniye cilt altında tutun. Herhangi bir geri akış meydana gelirse, kalan çözeltiyi çıkarmak için alanı bir mendille hafifçe kurulayın.
   NOT: Bazı deneylerde, hormonu uygulamak için susam yağı ile birleştirilmiş estradiol kullanılmıştır. Susam yağının bir araç olarak kullanılması, estradiol enjeksiyonu bölgelerinde cilt altında lokal iltihaplanmaya yol açar. Bu nedenle, estradiol enjeksiyon bölgelerinde iltihaplanma belirtilerinin olmadığı veya minimal olduğu sonraki deneyler için araç olarak mısır yağı seçildi²². Daha fazla ayrıntı için tartışmaya bakın.
7. İğneyi çıkardıktan sonra, bir pamuklu çubuk kullanarak enjeksiyon bölgesini topikal bir antiseptik ile nazikçe temizleyin. Bu, iğnenin farenin derisinden sokulması/çıkarılması nedeniyle enjeksiyon bölgesinde yüzeyde iltihaplanmayı önlemek içindir.
8. ERα (MCF-7) eksprese eden tümörleri barındıran farelere, hücre enjeksiyonundan 3 gün önce deri altına estradiol enjeksiyonları yapın, ardından 5 hafta boyunca haftada 5 kez enjekte edin (Şekil 1). ¹⁸F-FES probu ile hedefi olan ERα'ya rekabetçi bağlanmayı önlemek için görüntüleme gününden 2 gün önce estradiol enjeksiyonlarını durdurun.
   NOT: Bu çalışmada, MCF-7 tümörlerini barındıran farelere Pazartesi'den Cuma'ya günlük olarak estradiol enjekte edildi. Ertesi hafta Çarşamba günü görüntüleneceklerse, estradiol enjeksiyonları Cumartesi ve Pazar günleri devam etti. Estradiol, fareler Çarşamba günü görüntülenmeden önce Pazartesi ve Salı günleri uygulanmadı.

5. ¹⁸Yumurtalıklı farelerin F-FES PET ve MRI görüntülemesi

DİKKAT: Radyoaktivite ile çalışırken koruyucu ekipman kullanın. Radyoaktiviteyi ele alırken geçerli tüm düzenleyici prosedürleri izleyin.

1. Fareyi tartın ve ağırlığını kaydedin.
2. Bu çalışma için, ¹⁸F-FES, hayvan modellerinde kullanılmak üzere klinik derece^23'te (Austin Health Moleküler Görüntüleme ve Terapi Bölümü'nden elde edilmiştir) sentezlenmiş ve formüle edilmiştir. ¹⁸F-FES'i (109 dk radyoaktif yarı ömür), yaklaşık 150-300 μCi / 100 μL'lik ayarlanmış bozunmaya göre düzeltilmiş enjeksiyon konsantrasyonunda% 10 w / v etanol-salin çözeltisi içinde seyreltin.
   NOT: ERα^24'ün in vivo PET görüntülemesi için 1000 Ci/mmol'lük spesifik bir aktivite yeterlidir ve alınan ¹⁸F-FES, bu temel değerin üzerinde spesifik bir aktiviteye sahipti.
3. 29 G iğneli bir insülin şırıngası ile 100 μL çizin. Radyoaktivite dozunu ve süresini ölçmek ve kaydetmek için bir doz kalibratörü kullanın. Şırıngayı enjeksiyon zamanına kadar bir kurşun kalkanın arkasına yerleştirin.
   NOT: Bir doz kalibratörü ile her dozdaki ¹⁸F-FES radyoaktivite miktarını ölçün. Doz kalibratörü, üreticinin protokolüne göre sezyum-137 gibi standart bir referans materyaline göre kalibre edilmelidir. Çürüme düzeltmesini belirlemek için okuma zamanının kaydedilmesi önemlidir. Kalibratörde gösterilen saatin, PET alımı için kullanılan bilgisayardaki saatle eşleştiğinden emin olun.
4. İntravenöz enjeksiyon için kuyruk damarlarını genişletmek için, fareyi 2 dakika boyunca 30 cm mesafedeki bir ısıtma elemanının altına yerleştirin. Enjeksiyondan önce alanı dezenfekte etmek için kuyruğu %70 w / v etanol ile silin.
5. 100 μL ¹⁸F-FES'i (şırıngadaki tüm hacim) lateral kuyruk veni yoluyla bir bolus enjeksiyonu ile uygulayın ve enjeksiyon zamanını kaydedin. Kuyruk damarının kanamasını durdurmak için enjeksiyon bölgesine bir mendille bastırın.
6. Doz kalibratörünü kullanarak şırıngada kalan dozu ve dokuyu ölçün ve ölçümü ve süreyi kaydedin. Çok odacıklı görüntülemeye izin vermek için fareleri ikişerli gruplar halinde kademeli olarak enjekte edin.
   NOT: Şırıngada bir miktar prob bırakılacaktır. İnsülin şırıngalarının kullanımı, enjeksiyonun uygulanmasından sonra şırınga/iğne içinde sıkışan doz hacminin azalması nedeniyle Luer kilitleri aracılığıyla iğnelere bağlanan şırıngalara tercih edilir. Ek olarak, probun intravenöz enjeksiyonunu takiben oluşabilecek herhangi bir kanamayı durdurmak için kullanılan dokudaki radyoaktivite ölçülür. Bunun nedeni, doku tarafından emilen kanın geri akışının ¹⁸F-FES'ten bir miktar radyoaktivite içerebilmesidir. Ek olarak, yanal kuyruk damarlarını ısıtmak için geçen süre, ısı kaynağının yoğunluğu ve farelere ne kadar yakın olduğu gibi değişkenlere bağlı olacaktır. Standart ısı lambaları için damarların genişlemesi 15 dakika kadar sürebilir. Fareler aşırı ısınma belirtileri açısından yakından izlenmeli ve gerekirse enjeksiyonlar arasında ısıtma kaynağından çıkarılmalıdır.
7. Enjeksiyon sonrası uyumak üzere tahsis edilen fareler için, enjekte edilen fareyi, probun PET taramasından önce farenin sistemik dolaşımı yoluyla dağıtılmasına izin vermek için 1 saat boyunca bir ısıtma yastığı üzerinde izofluran (% 2 -% 2.5) ve oksijen (2 L / dak) bakım seviyesi altında tutulan anestezi odasına yerleştirin. Gruptaki diğer farelerin PET taramasına kadar 1-1,5 saat boyunca kafeslerinde serbestçe yürümelerine izin verin.
8. 1-1.5 saat sonra, fareyi burun konisi izofluran anestezisi altında bir görüntüleme odasına yerleştirin. Yatak ısıtıcısını 32 °C'ye getirin, çok odacıklı bir kurulum seçin ve solunum izleme sistemini açın. Görüntülenecek iki fareyi yüzüstü pozisyonda yerleştirin. Görüntüleme odasını PET/MRI makinesine yerleştirin.
9. Görüntü alımı boyunca farenin nefes alışını izleyin. Tarama sırasında herhangi bir zamanda dakikada 60-80 nefes almak için bir solunum çizelgesi kullanın. Solunum hızı istenen aralığın altına veya üstüne düşerse, izofluran dozunu gerektiği gibi ayarlayın.
   NOT: Görüntüleme odasında bir sensörün bulunması nedeniyle hayvanın solunumu izlenebilir.
10. Statik 15 dakikalık PET edinimini Gradient Echo (GRE) 3D eksenel MRI taraması ile eşleştirin. Edinme parametreleri için aşağıya bakın:
    1. PET protokolünü kurmak için ilgili yazılımda Radiopharmaceutical Editor (Radyofarmasötik Düzenleyici ) penceresini açınız. Kullanılan izotopu, şırınga aktivitesini (MBq), enjeksiyon süresini ve uygulanan aktiviteyi (MBq) ve vücut ağırlığını belirtin. Bu parametrelerin tümü, ilgilenilen dokudaki probun alımını hesaplamaya ve ölçmeye yardımcı olmak için gereklidir.
    2. Farenin görüntüleme için doğru şekilde konumlandırıldığından emin olmak için, PET görüş alanını belirlemek için bir 2D Scout (ön ve arka) dizisi kullanın. 400-600 keV'lik bir enerji penceresi, 1-5, 5 ns'lik tesadüf modu kullanarak 15 dakikalık statik PET alımına geçin. Bunu takiben yaklaşık 27 dakika boyunca bir GRE3D eksenel MRI taraması gerçekleştirin.
11. Elde edilen görüntüleri ilgili yazılımı kullanarak yeniden oluşturun.
    1. PET/MRI görüntüsünün statik rekonstrüksiyonunu gerçekleştirin ve optimum rekonstrüksiyon süresini sağlayarak farenin tamamını kapladığından emin olmak için rekonstrüksiyon alanını değiştirmek için geometrik planlayıcıyı kullanın.
    2. Sonuç Tanımlama penceresinin altında, rastgele düzeltmeler, zayıflama düzeltmesi (AC) + dağılım, konum aralığı ayarını Açık olarak değiştirin. Bozunma başvuru zamanını ADMIN olarak ayarlayın. Gövde-hava eşiğini %30'a ayarlayın ve zayıflama düzeltmesini malzeme haritasına dayandırın.
12. Çok odacıklı görüntülerin ayrılması, ortak kayıt ve ilgi bölgelerinin (ROI'ler) çizilmesi için ilgili yazılımı kullanın. Ortak kayıt için, MRG'yi PET'e uyacak şekilde yeniden hizalayın ve PET görüntüsünü yeniden oluşturun.
13. Çok odacıklı görüntüleri ayırmak için Görüntü İşleme > Segmentasyon > Otel Ayırıcı'ya tıklayın. Bilimsel Modu açın ve 2 nesne bulunana kadar eşik ve ses parametrelerini gerektiği gibi ayarlayın.
14. PET verilerini gram başına yüzde enjekte edilen doz birimine (%ID/g) dönüştürmek için şırıngada kalan herhangi bir kalıntı dozu hesaba kattıktan sonra enjeksiyon sırasında dozu girin veya PET verilerini standartlaştırılmış alım değeri birimine (SUV) dönüştürmek için ek olarak deneğin ağırlığını girin. PET veri kümesine sağ tıklayarak ve Temel Bilgiler sekmesindeki %ID/g alanını bularak bu dönüştürmeyi yapın. Daha önce kaydedilen %ID/g değerini girin.
15. Tümör bölümlerine ROI çizmek için, program penceresinin sol tarafındaki Ölçümler sekmesine tıklayın. Yatırım getirisini çokgen veya serbest el aracıyla çizin. Tümörün çevresini dikkatlice çizin ve PET görüntüsü aktif penceredeyken eylemin gerçekleştirildiğinden emin olun ( Fn-A kullanarak kontrol edin). Sonuç, ROI'nin değerini %ID/g olarak verir.
    NOT: ROI analizi, %ID/g için iyi bir tahmin verir. İyi kalibre edilmiş bir kamera, ex vivo biyodağıtım verilerine kıyasla %±5'lik bir doğruluk sağlamalıdır.

6. İmmünohistokimya için tümör dokusunun toplanması ve sabitlenmesi

1. Deneysel son noktada, izofluranın %4-5'te ölümcül solunması veya CO_2'nin aşırı solunması kullanılarak fareye ötenazi yapın.
2. Cerrahi makas ve cımbız kullanarak, tümörün yüzeyine yakın küçük bir kesi oluşturun ve tümör dokusunu rezeke edin. Deri tümör dokusuna bağlıysa, cildi tümörden nazikçe ayırmak için bir neşter bıçağı kullanın.
3. Tümör dokusunu yaklaşık 3 mL% 10 nötr tamponlu formalin içeren 5 mL'lik bir şişeye yerleştirin. Doku fiksasyonunu kolaylaştırmak için dokunun tamamının çözelti ile kaplandığından emin olun. Dokuyu 24 saat boyunca formalin içinde tutun.
4. Ertesi gün, sabit tümör dokusunu %70 etanol içeren 5 mL'lik bir şişeye aktarın. Parafin yerleştirmeye hazırlanırken tümör dokusuna özgü bir doku kasetini etiketleyin.
5. Tümör dokusunu bir doku kasetine yerleştirin ve parafin gömülene kadar% 70 etanol çözeltisinde saklayın.
   NOT: Bu çalışmada parafin yerleştirme, Austin Health'ten anatomik patologlar tarafından gerçekleştirilmiştir.

7. Östrojen reseptörü alfa (ERα) tespiti için immünohistokimya

1. Bir mikrotom kullanarak, standart prosedürleri izleyerek boyama için gerekli olan tümör dokusunun 4 μm kalınlığında kesitlerini kesin.
2. Kesilmiş tümör bölümleri olan cam mikroskop slaytlarını bir slayt rafına yerleştirin ve rafı gece boyunca kuruması ve boyamadan önce dokuların slaytlara yapışmasını sağlamak için 37 °C'lik bir fırına yerleştirin.
3. Ertesi sabah, mum alma işlemini kolaylaştırmak için kesilmiş tümör bölümleri içeren slaytların bulunduğu rafı 30 dakika boyunca 60 °C'lik bir fırına yerleştirin.
   NOT: Pişirme sırasında cam kızaklar yukarı bakmalıdır. Bu, doku yapışmasını sağlar ve eriyen herhangi bir balmumu, bitişik slaytlar yerine kendi slaytına erir.
4. Bölümleri yeniden sulandırmak için, pişmiş bölümleri iki kez, her biri 5 dakika (2x 5 dakika) 2x 5 dakika boyunca %100 etanol ve ardından 1x 5 dakika boyunca %70 etanol içine daldırın. Slaytları 5 dakika boyunca damıtılmış suda yıkayın.
5. Antijen alımı için, slaytları 100 ° C'lik bir su banyosunda 25-30 dakika boyunca pH 8 olan 1x EDTA tamponlu bir kaba daldırın. Slaytları su banyosundan çıkarın ve slaytların en az 1 saat RT'de oturmasına izin verin. Slaytlar soğuduktan sonra, 2 dakika akan musluk suyunda ve ardından TBST'de (% 0.01 Tween20 ile TBS) 2x 5 dakika yıkayın.
6. Hidrofobik bir bariyer kalemi kullanarak, slaytlardaki bölümlerin etrafına bir daire çizin.
7. RT'de 10 dakika boyunca bölümlere yaklaşık 100 μL% 3 H₂O₂ çözeltisi (damıtılmış suda seyreltilmiş) yerleştirerek endojen peroksidazları söndürün. Slaytları akan musluk suyunda 2 dakika ve ardından TBST'yi 2x 5 dakika yıkayın.
8. RT'de 30 dakika boyunca yaklaşık 100 μL / kesit blokaj tamponu (TBST'de% 5 sığır serum albümini (BSA)) ile bölümleri bloke edin.
9. Fazla çözeltiyi inkübasyon tepsisine hafifçe vurarak bloke edici tamponu boşaltın. 1:300 seyreltmede (veya kullanılan antikor için spesifik olarak önceden belirlenmiş optimal seyreltmede) bölümlere yaklaşık 100 μL birincil antikor (tavşanda yükseltilmiş insan anti-ERα) ekleyin. % 1 BSA TBST'de antikor dilüsyonları oluşturun ve gece boyunca 4 ° C'de antikorla inkübe etmek için slaytları yerleştirin.
   NOT: Bölümlerin gece boyunca kurumasını sağlamak için kuluçka tepsisinin alttan su ile doldurulması gerekir.
10. Ertesi sabah, slaytları TBST ile 3x 5 dakika yıkayın. Bölümlere yaklaşık 100 μL anti-tavşan ikincil antikoru ekleyin ve RT'de 45 dakika bekletin. Slaytları TBST ile 3x 5 dakika yıkayın.
11. Bir davlumbazda, bölümlere yaklaşık 100 μL 3,3'-diaminobenzidin (DAB) reaktifi ekleyin ve çözeltiyi bölüm başına yaklaşık 3 dakika açık tutun. Slaytları 10 dakika boyunca akan musluk suyuyla yıkayarak DAB reaksiyonunu inhibe edin.
12. Slaytları hematoksilen ile 1 dakika boyunca lekeleyin ve 2 dakika boyunca akan musluk suyunda durulayın. Slaytları 1 dakika Scott'ın suyuna batırın, ardından 2 dakika daha akan musluk suyunda durulayın.
13. Bölümleri kurutmak için, bölümleri 2 dakika boyunca %70 etanole, 2x 2 dakika boyunca %100 etanole ve ardından 2x 2 dakika ksilene batırın.
14. Bir çeker ocakta, bölümleri dibutil ftalat polistiren ksilen (DPX) içine dikkatlice monte edin ve bölümlerin üzerine bir lamel yerleştirin, böylece kabarcıkların ilgili doku üzerinde sıkışmamasını sağlayın. Slaytları çeker ocakta gece boyunca kurumaya bırakın.
15. Ertesi gün, görüntüleri yakalamak ve lekelenmeyi görselleştirmek için bir slayt tarayıcı kullanın.

ERα pozitif tümörlerin ¹⁸F-FES PET kullanılarak net bir şekilde görüntülenebileceği yeri belirlemek için, bu çalışmada üç yumurtalık faresi kohortu kullanıldı (Şekil 1). İki grup fareye, IMF'de veya omuzda ya da omuzda - bir ERα pozitif meme kanseri hücre hattı olan MCF-7 hücreleri enjekte edildi. Negatif bir kontrol olarak, başka bir fare kohortuna, ERα eksprese etmeyen, yaygın olarak kullanılan üçlü negatif meme ka...

Burada, ERα ekspresyonu ile karakterize meme tümörlerinin tespitinde ¹⁸F-FES PET/MRG'nin faydasını anlatıyoruz. Örnek olarak, ERα pozitif tümörlerin görüntülenebildiği bir yerin farelerin omzunda olduğunu gösteriyoruz - bu tümörler, 4^{. kasık} meme yağ yastığı içinde bulunan tümörlere kıyasla ¹⁸F-FES alımı ile açıkça tanımlanabilir (Şekil 4). ¹⁸MDA-MB-231 tümörlerinde F-FES tutulum...

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bu çalışma Ulusal Meme Kanseri Vakfı (IIRS-22-071) tarafından desteklenmiştir. Victoria Eyalet Hükümeti'nin Operasyonel Altyapı Destek programını kabul ediyoruz. Bu araştırma aynı zamanda Ulusal Görüntüleme Tesisi ve Victoria Hükümeti tarafından da desteklenen bir ANSTO-Austin-LICR Ortaklığı olan Katı Hedef Laboratuvarı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Yazarlar, Olivia Newton-John Kanser Araştırma Enstitüsü (ONJCRI) La Trobe-ONJCRI düğümünde bir Ulusal İşbirliğine Dayalı Araştırma Altyapısı Stratejisi (NCRIS) yeteneği olan Ulusal Görüntüleme Tesisi'nin bilimsel ve teknik yardımını kabul ederler. Şekil 1 ve 3 BioRender ile yapılmıştır.