Usando 16α-[18F]-fluoro-17β-estradiol PET para visualizar a expressão do receptor de estrogênio α em xenoenxertos de câncer de mama humano em camundongos ovariectomizados fêmeas

Aqui, demonstramos um protocolo para usar a tomografia por emissão de pósitrons (PET) 16α-[18F]-fluoro-17β-estradiol (¹⁸F-FES) como uma ferramenta para visualizar a expressão de ERα em xenoenxertos de mama ERα-positivos.

Para demonstrar como os xenoenxertos de câncer de mama positivos para receptor de estrogênio alfa (ERα) podem ser visualizados em camundongos nus BALB / c usando tomografia por emissão de pósitrons (PET) 16α-[18F] -fluoro-17β-estradiol (¹⁸F-FES), camundongos nus BALB / c ovariectomizados foram injetados com células de câncer de mama ERα-positivas (MCF-7, 3 × 10⁶ células; ombro [n = 10] ou^4ª almofada de gordura mamária inguinal [n = 10]) ou células de câncer de mama ERα-negativas (MDA-MB-231, 1 × 10⁶ células; almofada de gordura mamária [n = 5]). Camundongos com células MCF-7 receberam injeções subcutâneas de 20 μg de 17β-estradiol (20 μg / 20 μL; óleo de milho: etanol, 9: 1) na nuca 2 dias antes da injeção celular, seguidas de injeções diárias cinco vezes por semana durante 5 semanas. Os volumes tumorais foram medidos de acordo com a fórmula: (L*W²)/2 (L; comprimento, W; largura). Uma vez que os volumes tumorais atingiram aproximadamente 100 mm³, as injeções de 17β-estradiol foram interrompidas 2 dias antes de os camundongos receberem ¹⁸F-FES para imagens PET para evitar a ligação competitiva com ERα. Após a administração de ¹⁸F-FES através da veia lateral da cauda, PET/MRI foi realizada por 15 min em 1 h a 1,5 h após a injeção. ¹⁸A captação de F-FES não foi observada em camundongos portadores de tumor MDA-MB-231 ERα-negativos. ¹⁸A captação de F-FES foi mais pronunciada em camundongos com tumores MCF-7 no ombro. Nos tumores MCF-7 cultivados na gordura mamária inguinal, a captação de ¹⁸F-FES foi menos visível, pois o padrão de excreção intestinal de ¹⁸F-FES obscureceu a radioatividade detectável nesses tumores. Para usar ¹⁸F-FES PET como uma ferramenta para visualizar a expressão de ERα em xenoenxertos de mama ERα-positivos, demonstramos que a visibilidade da captação de ¹⁸F-FES é clara em tumores localizados longe da região abdominal de camundongos, como no ombro.

Os cânceres de mama (CM) podem ser estratificados em diferentes subtipos moleculares¹. Os tumores de mama classificados como subtipo luminal superexpressam o receptor de estrogênio alfa (ERα). Como tal, este subtipo de CB também é referido como ERα-positivo (ERα⁺). Felizmente, aqueles diagnosticados com CM ERα⁺ experimentam a maior sobrevida em 10 anos, juntamente com baixas taxas de metástase à distância ^2,3. Devido à expressão de ERα, esses pacientes têm acesso a uma coleção de opções de terapia hormonal, incluindo moduladores seletivos do receptor de estrogênio (SERMs), drogas antiestrogênicas e inibidores da aromatase⁴.

Para avaliar se uma paciente com câncer de mama é elegível para terapia hormonal, os níveis de expressão de ERα em tumores de mama devem ser determinados ^5,6,7. Embora o padrão-ouro de teste seja conduzido usando métodos de imuno-histoquímica (IHQ), muitos relatos destacam a questão da reprodutibilidade e confiabilidade dos resultados obtidos ^6,8,9. A IHQ pode dar origem a discordância de resultados, pois a técnica é de natureza semiquantitativa, onde diferenças no processamento tecidual e subsequente interpretação podem levar à variabilidade⁶. Para corrigir esse problema recorrente, diretrizes foram estabelecidas em 2010 e atualizadas em 2020 pela Sociedade Americana de Oncologia Clínica com a intenção de reduzir a variação interobservador¹⁰. Atualmente, o ponto de corte clinicamente validado é de ≥1%, com a expressão de ERα mesmo em níveis de expressão muito pequenos demonstrando benefícios clinicamente significativos usando terapia endócrina¹¹.

No CM avançado, a expressão de ERα pode diferir entre metástases e o tumor primário. Algumas observações relatam uma discrepância de 18% a 55% nos níveis de expressão de ERα entre as lesões metastáticas e o tumor primário, apontando para a importância de determinar o status de ERα das metástases de^CB12. Para resolver isso, as diretrizes destacam a importância de confirmar o status do receptor hormonal em lesões metastáticas para fazer planos de tratamento informados^13,14. No entanto, a viabilidade disso é questionável, principalmente por meio de métodos de IHQ, considerando que podem existir metástases em locais de difícil realização de biópsias.

Os métodos de imagem molecular surgiram para se tornarem ferramentas essenciais para a detecção e visualização de lesões tumorais em pacientes com câncer. Em particular, a tomografia por emissão de pósitrons (PET) requer o uso de traçadores ou, mais especificamente, radiofármacos, que são projetados para explorar certas características dos tumores com a intenção de visualizar essas lesões de forma não invasiva. O traçador de PET mais comum usado em oncologia é o ¹⁸F-fluorodesoxiglicose (¹⁸F-FDG)¹⁵. Neste estudo, exploramos o uso de uma forma radiomarcada de estradiol, ¹⁸F-fluoroestradiol (¹⁸F-FES). O estradiol - um ligante para ERα - é um hormônio produzido predominantemente pelos ovários nas mulheres¹⁶. ¹⁸O F-FES recebeu aprovação recente da Food and Drug Administration (FDA) e é comercializado como Cerianna^TM. Este agente de imagem foi projetado para ser usado como adjuvante de biópsias em pacientes com CM recorrente ou metastático¹⁷. A PET de corpo inteiro com ¹⁸F-FES pode ser usada como um método não invasivo para detectar os níveis de ERα tanto no tumor primário quanto em metástases à distância em regiões das quais as biópsias são difíceis de obter¹⁸. A previsão dos níveis de ERα usando imagens de PET ^{de 18}F-FES se correlaciona com os resultados de IHQ e, além disso, pouca ou nenhuma detecção de ERα usando imagens de PET ^{de 18}F-FES é um preditor confiável de tumores que provavelmente não responderão à terapia hormonal¹⁸. Para garantir o uso adequado de ¹⁸F-FES na clínica, diretrizes foram formuladas por consenso por especialistas na área¹⁹. Neste estudo, avaliamos o uso de ¹⁸F-FES PET em modelos pré-clínicos de câncer de mama em camundongos.

Todos os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Hospital de Austin (A2023/05812) e conduzidos em conformidade com o Código Australiano para o cuidado e uso de animais para fins científicos.

1. Preparação celular

1. Usando procedimentos de cultura de células de rotina, manter as células MDA-MB-231 e MCF-7 em DMEM/F-12 suplementadas com penicilina/estreptomicina e 10% de soro fetal bovino (FBS) em frascos de cultura de tecidos T175. Antes de preparar as células para injeção, passe as células pelo menos 3x após o renascimento dos estoques de nitrogênio líquido. Cultive as células em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de CO₂.
2. Propague as células de modo que, no dia da preparação das células para injeção, haja 3 × 10⁶ células MCF-7 por injeção por camundongo para 15 camundongos (ou seja, pelo menos 45 × 10⁶ células MCF-7) e 1 × 10⁶ células MDA-MB-231 por injeção por camundongo para 5 camundongos (ou seja, pelo menos 5 × 10⁶ células MDA-MB-231).
   NOTA: Para permitir um número igual de células em cada camundongo, prepare células suficientes para cinco injeções extras (por exemplo, prepare células suficientes para 10 injeções para injetar cinco camundongos).
3. No dia da injeção celular, remova o meio de todos os frascos e coloque aproximadamente 5 mL de tripsina-EDTA (0,25% de tripsina e 0,05% de EDTA) em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,4) nas células para facilitar o descolamento celular.
4. Uma vez que as células tenham se desprendido, coloque aproximadamente 10 mL de meio completo em frascos para inibir a atividade da tripsina. Ressuspenda as células e transfira a suspensão unicelular para um tubo de 50 mL. Centrifugue a ~ 300 × g por 2 min para pellet células.
5. Ressuspenda o pellet celular em um volume apropriado de meio e conte as células para determinar o número total de células colhidas.
   NOTA: Procure contar soluções de cerca de 1 × 10⁶ células por mL (50-100 células por 16 quadrados se estiver usando uma câmara de contagem). Para células que crescem a 5 × 10⁶ por frasco cheio, colha células em 5 mL de meio. Para linhagens celulares com densidade mais elevada, utilizar 10 ml de meio por balão.
6. Execute esta etapa no gelo em um gabinete de fluxo laminar estéril. Uma vez atingido este número, centrifugue novamente a suspensão celular a 300 × g durante 2 min para granular as células. Ressuspenda o pellet em PBS frio e solução de matriz de membrana basal gelada de modo que por 3 × 10⁶ células MCF-7, haja 40 μL de PBS e 10 μL de solução de matriz de membrana basal.
7. Ressuspenda o pellet de células MDA-MB-231 com os mesmos constituintes, de modo que por 1 × 10⁶ células, haja 40 μL de PBS e 10 μL de solução de matriz de membrana basal. Transfira a mistura de matriz de membrana celular-PBS-basal do tubo de 50 mL para tubos menores de 1,5 mL com uma ponta de pipeta fria e mantenha a mistura de células no gelo imediatamente antes da injeção celular em camundongos.
   NOTA: A matriz da membrana basal usada neste estudo é armazenada a -20 °C. Um dia antes de ser necessária a solução da matriz da membrana basal, coloca-se uma alíquota da solução a 4 °C para descongelar durante a noite. No dia seguinte, está pronto para uso em temperaturas frias (no gelo). Ao pipetar a solução, certifique-se de que as pontas da pipeta usadas estejam frias para evitar que a solução da matriz da membrana basal se solidifique. É uma boa prática manter uma caixa de ponteiras de pipeta estéreis no frigorífico antes do dia da preparação das células para injeção. Ao ressuspender o pellet celular em PBS gelado e solução de matriz de membrana basal, o PBS é adicionado primeiro, seguido pela quantidade necessária de solução de matriz de membrana basal.

2. Injeção de células em camundongos ovariectomizados

1. Permita que camundongos nus BALB/c ovariectomizados fêmeas de 6 a 8 semanas de idade se aclimatem no alojamento dos animais por pelo menos 1 semana antes da injeção de células.
   NOTA: Este estudo teve acesso a camundongos mais velhos, de 12 a 14 semanas de idade. A ovariectomia garante baixos níveis de estradiol endógeno e reduz a competição com o ligante ¹⁸F-FES. Dependendo do modelo em estudo, camundongos mais jovens (por exemplo, 4-8 semanas) podem não precisar ser submetidos à ovariectomia devido aos níveis mais baixos de estradiol endógeno^20,21.
2. Induza a anestesia em um camundongo com isoflurano a 4% e oxigênio a uma taxa de 4 L / min usando uma câmara de indução de anestesia. Observe o mouse e verifique se há perda de reflexo de endireitamento. Quando eles não estiverem mais se movendo, transfira o camundongo para um gabinete de fluxo laminar estéril, coloque o focinho na máscara nasal e mantenha a anestesia ajustando o isoflurano a 2% e o oxigênio a uma taxa de 2 L / min.
   NOTA: Anestesiar um rato de cada vez para garantir o cuidado ideal.
3. Para injeções de almofada de gordura intramamária (IMF), esfregue a pele sobre a^4ª glândula mamária inguinal com álcool. Use uma seringa pré-resfriada (com gelo) de 27 G para aspirar a suspensão de células frias e deixe a seringa no gelo para evitar o aquecimento/solidificação da solução da matriz da membrana basal antes da injeção.
4. Usando o polegar e o indicador da mão não dominante, levante suavemente a^4ª glândula mamária e insira uma agulha de seringa 27 G com a mão dominante, garantindo que o chanfro da agulha esteja voltado para cima. Injete lentamente 50 μL da suspensão celular contendo a mistura de solução de matriz de membrana celular-PBS-basal na almofada de gordura mamária.
   NOTA: Uma bolha deve ser sentida entre os dedos à medida que as células são injetadas. Verifique se há vazamentos no local da injeção.
5. Assim que a injeção for concluída, desligue o isoflurano e mantenha o focinho do camundongo no cone do nariz para respirar oxigênio e recuperar a consciência (isso deve levar cerca de um minuto). Coloque o mouse de volta em uma gaiola em uma almofada de calor para uma recuperação ideal.
6. Para injeções no ombro, use o procedimento descrito acima para injeção de IMF, a única diferença é o local da injeção de células.
   NOTA: Alternativamente, a injeção no ombro pode ser concluída sem anestesia (consulte a etapa 2.7 abaixo).
7. Para injeção no ombro sem anestesia, segure e levante a pele sobre o ombro do camundongo usando a mão não dominante entre o polegar e o indicador, formando uma 'tenda' na pele. Injete lentamente 50 μL de suspensão celular contendo a solução de matriz de membrana basal célula-PBS usando uma agulha de seringa de 27 G. Retire a agulha com cuidado e verifique se há vazamentos.
   NOTA: Como alternativa, uma seringa Hamilton pode ser usada para injeções de pequeno volume para garantir a precisão da entrega do volume. Entre as injeções, o etanol 80% v/v é usado para enxaguar a seringa ao usar diferentes linhas celulares, e o PBS é usado para enxaguar e remover o etanol residual da seringa.

3. Preparação da solução de estradiol

1. Usando uma balança que pode medir com precisão miligramas de uma substância, pese 7 mg de pó de estradiol em um tubo de 1,5 mL.
2. Adicione 700 μL de etanol 100% em 7 mg de estradiol em pó. Coloque o tubo de 1,5 ml num agitador suave durante aproximadamente 1 h à temperatura ambiente (RT) ou até que o pó de estradiol esteja totalmente dissolvido.
3. Alíquota da solução em dez tubos de 1,5 ml, cada um contendo 70 μL de solução de etanol-estradiol. Coloque os tubos a -20 °C para uso futuro.
   NOTA: Os estoques de estradiol-etanol podem ser mantidos a -20 °C por cerca de 2 semanas.

4. Injeção subcutânea de solução de estradiol

1. No dia em que for necessária uma injeção de estradiol, preparar a seguinte mistura fresca. Combine 630 μL de óleo de milho como veículo no tubo de 1,5 mL contendo 70 μL da solução de etanol-estradiol. Vortex a solução até ficar homogênea, garantindo que o etanol não se separe e forme uma camada na parte superior do óleo do veículo.
   NOTA: Isso produz 700 μL de uma solução de óleo de milho: etanol de 20 μg / 20 μL, 9: 1. Cada camundongo recebe 20 μL desta solução. Sempre faça uma solução extra, pois o óleo na mistura tende a aderir à parte externa da seringa e nas laterais de um tubo de 1,5 mL devido à sua viscosidade (por exemplo, para 20 camundongos, embora 400 μL sejam suficientes, fazendo quase o dobro da quantidade (700 μL) fornece espaço suficiente para erros).
2. Usando uma agulha de 29 G conectada a uma seringa de insulina, aspire lentamente 20 μL de solução de estradiol.
   NOTA: Como a solução contém 9 partes de óleo para 1 parte de estradiol-etanol, a mistura levará tempo para entrar na seringa.
3. Os camundongos a serem injetados com solução de estradiol são aqueles que abrigam tumores que expressam ERα e, portanto, dependem do estrogênio para crescer (MCF-7 neste estudo). Camundongos que abrigam tumores que não expressam ERα (MDA-MB-231 neste estudo) não recebem solução de estradiol. Posicione suavemente o mouse a ser injetado na frente, de preferência em uma toalha, para evitar machucar seus membros durante a contenção.
4. Usando a mão não dominante, prenda o mouse segurando a parte superior de sua cauda entre o dedo anelar e o dedo mindinho. Use o polegar e o indicador para levantar a pele solta perto do pescoço do camundongo para formar uma 'tenda' na pele para injeção subcutânea da solução de estradiol.
5. Enquanto mantém o camundongo nessa restrição, use a mão dominante para injetar o camundongo com a solução de estradiol. Com o bisel da agulha virado para cima, empurre a agulha por baixo da «tenda» da pele até que menos de metade da agulha esteja visível.
   NOTA: À medida que a solução é injetada, a pele deve visivelmente inchar para fora.
6. Para evitar qualquer refluxo da solução, mantenha a agulha sob a pele por alguns segundos. Se ocorrer algum refluxo, seque suavemente a área com um lenço de papel para remover a solução residual.
   NOTA: Em alguns experimentos, o estradiol combinado com óleo de gergelim foi usado para administrar o hormônio. O uso de óleo de gergelim como veículo leva à inflamação local sob a pele nos locais da injeção de estradiol. Assim, o óleo de milho foi escolhido como veículo para experimentos subsequentes, nos quais os sinais de inflamação nos locais de injeção de estradiol estavam ausentes ou eram mínimos²². Veja a discussão para mais detalhes.
7. Depois de remover a agulha, limpe suavemente o local da injeção com um anti-séptico tópico usando um cotonete. Isso é para evitar inflamação na superfície no local da injeção devido à inserção/remoção da agulha através da pele do camundongo.
8. Injete os camundongos que abrigam tumores que expressam ERα (MCF-7) com injeções de estradiol por via subcutânea 3 dias antes da injeção celular, seguidas de 5 vezes por semana durante 5 semanas (Figura 1). Interrompa as injeções de estradiol 2 dias antes do dia da imagem para evitar a ligação competitiva com a sonda ¹⁸F-FES ao seu alvo, ERα.
   NOTA: Neste estudo, camundongos portadores de tumores MCF-7 foram injetados com estradiol diariamente de segunda a sexta-feira. Se eles fossem fotografados na semana seguinte, em uma quarta-feira, as injeções de estradiol continuavam no sábado e no domingo. O estradiol não foi administrado na segunda e terça-feira antes que os camundongos fossem fotografados na quarta-feira.

5. ¹⁸F-FES PET e imagens de ressonância magnética de camundongos ovariectomizados

CUIDADO: Use equipamento de proteção ao manusear a radioatividade. Siga todos os procedimentos regulamentares aplicáveis ao manusear a radioatividade.

1. Pese o mouse e registre seu peso.
2. Para este estudo, ¹⁸F-FES foi sintetizado e formulado em grau clínico²³ (obtido no Departamento de Imagem e Terapia Molecular, Austin Health) para uso em modelos animais. Diluir ¹⁸F-FES (meia-vida radioativa de 109 min) em solução salina de etanol a 10% p / v a uma concentração de injeção corrigida por decaimento ajustada de aproximadamente 150-300 μCi / 100 μL.
   NOTA: Uma atividade específica de 1000 Ci / mmol é suficiente para imagens PET in vivo de ERα²⁴, e os ¹⁸F-FES recebidos tiveram uma atividade específica acima desse valor basal.
3. Aspirar 100 μL com uma seringa de insulina com uma agulha de 29 G. Use um calibrador de dose para medir e registrar a dose e o tempo de radioatividade. Coloque a seringa atrás de um escudo de chumbo até o momento da injeção.
   NOTA: Meça a quantidade de ¹⁸F-FES de radioatividade em cada dose com um calibrador de dose. O calibrador de dose deve ser calibrado em relação a um material de referência padrão, como césio-137, de acordo com o protocolo do fabricante. O tempo da leitura é importante para registrar para determinar a correção do decaimento. Certifique-se de que o tempo mostrado no calibrador corresponda ao tempo no computador usado para aquisição de PET.
4. Para dilatar as veias da cauda para injeção intravenosa, coloque o mouse sob um elemento de aquecimento a uma distância de 30 cm por 2 min. Limpe a cauda com etanol 70% p/v para desinfetar a área antes da injeção.
5. Administre 100 μL de ¹⁸F-FES (todo o volume da seringa) com uma injeção em bolus através da veia da cauda lateral e registre o momento da injeção. Pressione o local da injeção com um lenço de papel para impedir o sangramento da veia da cauda.
6. Meça a dose restante na seringa mais o tecido usando o calibrador de dose e registre a medição e o tempo. Injete camundongos escalonados em lotes de dois para permitir a imagem usando a multicâmara.
   NOTA: Alguma sonda será deixada na seringa. O uso de seringas de insulina é preferível às seringas conectadas a agulhas por meio de travas Luer devido à diminuição do volume de dose retido na seringa/agulha após a administração da injeção. Além disso, a radioatividade no tecido que é usada para parar qualquer sangramento que possa ocorrer após a injeção intravenosa da sonda é medida. Isso ocorre porque o refluxo do sangue absorvido pelo tecido pode conter alguma radioatividade de ¹⁸F-FES. Além disso, o tempo necessário para aquecer as veias laterais da cauda dependerá de variáveis como a intensidade da fonte de calor e a proximidade dos camundongos. Para lâmpadas de calor padrão, pode levar até 15 minutos para as veias dilatarem. Os camundongos devem ser monitorados de perto quanto a sinais de superaquecimento e removidos da fonte de aquecimento entre as injeções, se necessário.
7. Para camundongos alocados para dormir após a injeção, coloque o camundongo injetado na câmara de anestesia mantida sob um nível de manutenção de isoflurano (2%-2,5%) e oxigênio (2 L/min) por 1 h em uma almofada de aquecimento para permitir que a sonda seja distribuída através da circulação sistêmica do camundongo antes do PET scan. Permita que os outros camundongos do grupo andem livremente em sua gaiola por 1-1,5 h até o PET scan.
8. Após 1-1,5 h, coloque o camundongo em uma câmara de imagem sob anestesia com isoflurano do cone nasal. Ligue o aquecedor de cama a 32 °C, selecione uma configuração multicâmara e ligue o sistema de monitoramento respiratório. Coloque os dois mouses a serem fotografados em uma posição de bruços. Coloque a câmara de imagem na máquina de PET/MRI.
9. Monitore a respiração do mouse durante a aquisição da imagem. Use um gráfico de respiração para garantir 60-80 respirações por minuto a qualquer momento durante o exame. Se a frequência respiratória cair abaixo ou acima da faixa desejada, ajuste a dose de isoflurano conforme necessário.
   NOTA: A respiração do animal pode ser monitorada devido à presença de um sensor na câmara de imagem.
10. Emparelhe uma aquisição estática de PET de 15 minutos com uma ressonância magnética axial 3D Gradient Echo (GRE). Veja abaixo os parâmetros de aquisição:
    1. Para configurar o protocolo PET, abra a janela Editor de radiofármacos no software relevante. Especificar o isótopo utilizado, a actividade da seringa (MBq), o tempo de injecção e a actividade aplicada (MBq) e o peso corporal. Todos esses parâmetros são essenciais para ajudar a calcular e quantificar a captação da sonda no tecido de interesse.
    2. Para garantir que o mouse esteja posicionado corretamente para a geração de imagens, use uma sequência 2D Scout (frente e verso) para determinar o campo de visão do PET. Prossiga para uma aquisição de PET estática de 15 minutos usando uma janela de energia de 400-600 keV, modo de coincidência de 1-5, 5 ns. Realize uma ressonância magnética axial GRE3D por aproximadamente 27 minutos depois disso.
11. Reconstrua as imagens adquiridas usando o software relevante.
    1. Realize a reconstrução estática da imagem PET/MRI e use o planejador geométrico para modificar a área de reconstrução para garantir que ela cubra a totalidade do mouse, garantindo o tempo ideal de reconstrução.
    2. Na janela Identificação de resultados , alterne as correções aleatórias, correção de atenuação (AC) + dispersão, intervalo de posição para Ligado. Defina o tempo de referência de decaimento como ADMIN. Defina o limite corpo-ar para 30% e baseie a correção de atenuação no mapa de materiais.
12. Use software relevante para a separação de imagens multicâmaras, co-registro e para desenhar regiões de interesse (ROIs). Para co-registro, realinhe a ressonância magnética para caber no PET e reconstrua a imagem PET.
13. Para separar as imagens multicâmaras, clique em Processamento > Segmentação de Imagens > Separador de Hotel. Ative o Modo Científico e ajuste os parâmetros de limite e volume conforme necessário até que 2 objetos sejam encontrados.
14. Insira a dose no momento da injeção após contabilizar qualquer dose residual deixada na seringa para converter os dados PET na unidade de dose percentual injetada por grama (% ID / g) ou, adicionalmente, insira o peso do sujeito para converter os dados PET na unidade de valor de captação padronizado (SUV). Faça essa conversão clicando com o botão direito do mouse no conjunto de dados PET e localizando o campo %ID/g na guia Informações básicas . Insira o %ID/g registrado anteriormente.
15. Para desenhar ROIs nas seções do tumor, clique na guia Medições no lado esquerdo da janela do programa. Desenhe o ROI com o polígono ou a ferramenta à mão livre . Desenhe cuidadosamente ao redor da circunferência do tumor, garantindo que a ação seja realizada enquanto a imagem PET estiver na janela ativa (verifique usando Fn-A). O resultado fornece um valor do ROI como %ID/g.
    NOTA: A análise de ROI fornece uma boa estimativa do %ID/g. Uma câmera bem calibrada deve fornecer uma precisão de ±5% em comparação com os dados de biodistribuição ex vivo .

6. Coleta e fixação de tecido tumoral para imuno-histoquímica

1. No endpoint experimental, eutanasiar o camundongo usando inalação letal de isoflurano a 4% -5% ou inalação excessiva de CO₂.
2. Usando tesouras e pinças cirúrgicas, crie cuidadosamente uma pequena incisão perto da superfície do tumor e ressece o tecido tumoral. Se a pele estiver presa ao tecido tumoral, use uma lâmina de bisturi para separar suavemente a pele do tumor.
3. Coloque o tecido tumoral em um frasco de 5 mL contendo aproximadamente 3 mL de formalina tamponada neutra a 10%. Certifique-se de que todo o tecido esteja coberto com solução para facilitar a fixação do tecido. Mantenha o tecido submerso em formalina por 24 h.
4. No dia seguinte, transfira o tecido tumoral fixado para um frasco de 5 mL contendo etanol a 70%. Rotule um de tecido específico para o tecido tumoral em preparação para inclusão em parafina.
5. Coloque o tecido tumoral em um de tecido e armazene-o em uma solução de etanol a 70% até a inclusão em parafina.
   NOTA: Neste estudo, a inclusão de parafina foi conduzida por patologistas anatômicos da Austin Health.

7. Imuno-histoquímica para a detecção do receptor de estrogênio alfa (ERα)

1. Usando um micrótomo, corte seções de 4 μm de espessura do tecido tumoral necessário para a coloração, seguindo os procedimentos padrão.
2. Coloque as lâminas de microscópio de vidro com seções de tumor cortadas em um rack de lâminas e coloque o rack em um forno a 37 ° C para secar durante a noite e garantir que os tecidos adiram às lâminas antes da coloração.
3. Na manhã seguinte, coloque o rack com lâminas contendo seções de tumor cortadas em um forno a 60 ° C por 30 min para facilitar o processo de desparafinação.
   NOTA: As lâminas de vidro devem ficar voltadas para cima durante o cozimento. Isso garante a aderência do tecido, e qualquer cera que derreta derrete em sua própria lâmina, em vez de lâminas adjacentes.
4. Para reidratar as seções, mergulhe as seções cozidas em xileno duas vezes, 5 min cada (2x 5 min) 100% etanol por 2x 5 min e depois 70% etanol por 1x 5 min. Lave as lâminas em água destilada por 5 min.
5. Para a recuperação do antígeno, mergulhe as lâminas em um recipiente de 1x tampão EDTA, pH 8, por 25-30 min em banho-maria a 100 °C. Retirar as lâminas do banho-maria e deixar as lâminas à temperatura em repouso durante pelo menos 1 h. Depois que as lâminas esfriarem, lave-as em água corrente da torneira por 2 min e depois TBST (TBS com 0,01% Tween20) por 2x 5 min.
6. Usando uma caneta de barreira hidrofóbica, desenhe um círculo ao redor das seções nas lâminas.
7. Extinguir as peroxidases endógenas colocando aproximadamente 100 μL de solução de 3% de H₂O₂ (diluída em água destilada) em seções por 10 min em RT. Lave as lâminas em água corrente da torneira por 2 min e depois TBST por 2x 5 min.
8. Seções de bloqueio com aproximadamente 100 μL/seção de tampão de bloqueio (albumina de soro bovino (BSA) a 5% em TBST) por 30 min em RT.
9. Drene o tampão de bloqueio sacudindo suavemente o excesso de solução na bandeja de incubação. Adicionar aproximadamente 100 μL de anticorpo primário (anti-ERα humano criado em coelhos) às secções a uma diluição de 1:300 (ou a uma diluição pré-determinada ideal específica para o anticorpo utilizado). Completar diluições de anticorpos em 1% BSA TBST e colocar lâminas para incubar com o anticorpo a 4 °C durante a noite.
   NOTA: A bandeja de incubação deve ser preenchida com água na parte inferior para garantir que as seções não sequem durante a noite.
10. Na manhã seguinte, lave as lâminas com TBST por 3x 5 min. Adicione aproximadamente 100 μL de anticorpo secundário anti-coelho nas seções e deixe agir por 45 min em RT. Lave as lâminas com TBST por 3x 5 min.
11. Em uma capela, adicione aproximadamente 100 μL de reagente de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) nas seções e mantenha a solução por aproximadamente 3 min por seção. Inibir a reação DAB lavando as lâminas com água corrente da torneira por 10 min.
12. Contra-core as lâminas com hematoxilina por 1 min e enxágue em água corrente da torneira por 2 min. Mergulhe as lâminas na água de Scott por 1 minuto e depois enxágue em água corrente da torneira por mais 2 minutos.
13. Para desidratar seções, mergulhe as seções em etanol a 70% por 2 min, etanol a 100% por 2x 2 min e depois xileno por 2x 2 min.
14. Em uma capela de exaustão, monte cuidadosamente as seções em dibutil ftalato poliestireno xileno (DPX) e coloque uma lamínula sobre as seções, garantindo que as bolhas não fiquem presas sobre o tecido de interesse. Deixar as lâminas secarem durante a noite na hotte.
15. No dia seguinte, use um scanner de lâminas para capturar imagens e visualizar a coloração.

Para determinar o local para o qual os tumores ERα positivos podem ser claramente visualizados usando ¹⁸F-FES PET, três coortes de camundongos ovariectomizados foram usadas neste estudo (Figura 1). Dois grupos de camundongos foram injetados com células MCF-7 - uma linhagem celular de câncer de mama ERα positiva - IMF ou no ombro. Como controle negativo, outra coorte de camundongos foi injetada com células MDA-MB-231, uma linha celular de câ...

Aqui, descrevemos a utilidade de ¹⁸F-FES PET/MRI na detecção de tumores de mama caracterizados pela expressão de ERα. Como exemplo, demonstramos que um local no qual os tumores ERα positivos podem ser visualizados é no ombro de camundongos - esses tumores podem ser claramente identificados pela captação de ¹⁸F-FES, em comparação com tumores localizados dentro da^4ª almofada de gordura mamária inguinal (Figura 4). <...

Os autores não têm nada a divulgar.

Este trabalho foi apoiado pela National Breast Cancer Foundation (IIRS-22-071). Reconhecemos o programa de Apoio à Infraestrutura Operacional do Governo do Estado de Victoria. Esta pesquisa também foi realizada usando o Solid Target Laboratory, uma parceria ANSTO-Austin-LICR, também apoiada pelo National Imaging Facility e pelo governo de Victoria. Os autores reconhecem a assistência científica e técnica do National Imaging Facility, uma capacidade da National Collaborative Research Infrastructure Strategy (NCRIS), no nó La Trobe-ONJCRI, Olivia Newton-John Cancer Research Institute (ONJCRI). As Figuras 1 e 3 foram feitas com BioRender.