Uso de PET con 16α-[18F]-fluoro-17β-estradiol para visualizar la expresión del receptor de estrógeno α en xenoinjertos de cáncer de mama humano en ratones hembra ovariectomizados

Aquí, demostramos un protocolo para usar la tomografía por emisión de positrones (PET) con 16α-[18F]-fluoro-17β-estradiol (¹⁸F-FES) como herramienta para visualizar la expresión de ERα en xenoinjertos de mama ERα positivos.

Para demostrar cómo se pueden visualizar xenoinjertos de cáncer de mama positivos para el receptor de estrógeno alfa (ERα) en ratones desnudos BALB/c utilizando tomografía por emisión de positrones (PET) con 16α-[18F]-fluoro-17β-estradiol (¹⁸F-FES), ratones desnudos BALB/c ovariectomizados se inyectaron células de cáncer de mama ERα positivas (MCF-7, 3 × 10⁶ células; hombro [n = 10] o^4ª almohadilla de grasa mamaria inguinal [n = 10]) o células de cáncer de mama ERα negativas (MDA-MB-231, 1 × 10⁶ celdas; almohadilla de grasa mamaria [n = 5]). Los ratones que albergaban células MCF-7 recibieron inyecciones subcutáneas de 20 μg de 17β-estradiol (20 μg/20 μL; aceite de maíz:etanol, 9:1) en la nuca 2 días antes de la inyección celular, seguidas de inyecciones diarias cinco veces por semana durante 5 semanas. Los volúmenes tumorales se midieron según la fórmula: (L*W²)/2 (L; largo, W; ancho). Una vez que los volúmenes tumorales alcanzaron aproximadamente 100^mm3, las inyecciones de 17β-estradiol se suspendieron 2 días antes de que los ratones recibieran ¹⁸F-FES para la PET para evitar la unión competitiva con ERα. Tras la administración de ¹⁸F-FES a través de la vena lateral de la cola, se realizó una PET/RM durante 15 min entre 1 h y 1,5 h después de la inyección. ¹⁸No se observó la absorción de F-FES en ratones portadores de tumores ERα negativos, MDA-MB-231. ¹⁸La absorción de F-FES fue más pronunciada en los ratones que albergaban tumores MCF-7 en el hombro. En los tumores MCF-7 cultivados en la almohadilla de grasa mamaria inguinal, la absorción de ¹⁸F-FES fue menos visible, ya que el patrón de excreción intestinal de ¹⁸F-FES oscureció la radiactividad detectable en estos tumores. Con el fin de utilizar ¹⁸F-FES PET como herramienta para visualizar la expresión de ERα en xenoinjertos de mama ERα positivos, demostramos que la visibilidad de la captación de ¹⁸F-FES es clara en tumores localizados lejos de la región abdominal de los ratones, como en el hombro.

Los cánceres de mama (CM) se pueden estratificar en diferentes subtipos moleculares¹. Los tumores de mama que se clasifican como el subtipo luminal sobreexpresan el receptor de estrógeno alfa (ERα). Como tal, este subtipo de BC también se conoce como ERα-positivo (ERα⁺). Afortunadamente, los diagnosticados con ERα⁺ BC experimentan la supervivencia más alta a 10 años junto con bajas tasas de metástasis a distancia ^2,3. Debido a la expresión de ERα, estos pacientes tienen acceso a una colección de opciones de terapia hormonal, incluidos los moduladores selectivos de los receptores de estrógeno (MSRE), los fármacos antiestrógenos y los inhibidores de la aromatasa⁴.

Para evaluar si una paciente con cáncer de mama es elegible para la terapia hormonal, se deben determinar los niveles de expresión de ERα dentro de los tumores de mama ^5,6,7. Si bien el estándar de oro de las pruebas se realiza utilizando métodos de inmunohistoquímica (IHQ), muchos informes destacan el problema de la reproducibilidad y confiabilidad de los resultados obtenidos ^6,8,9. La IHQ puede dar lugar a discordancia en los resultados, ya que la técnica es de naturaleza semicuantitativa, donde las diferencias en el procesamiento de los tejidos y la posterior interpretación pueden conducir a la variabilidad⁶. Para corregir este problema recurrente, en 2010 se establecieron directrices y la Sociedad Americana de Oncología Clínica las actualizó en 2020 con la intención de reducir la variación interobservador¹⁰. Actualmente, el punto de corte clínicamente validado se sitúa en el ≥1%, con la expresión de ERα incluso a niveles de expresión muy pequeños, demostrando beneficios clínicamente significativos mediante el uso de la terapia endocrina¹¹.

En el CM avanzado, la expresión de ERα puede diferir entre las metástasis y el tumor primario. Algunas observaciones reportan una discrepancia del 18-55% en los niveles de expresión de ERα entre las lesiones metastásicas y el tumor primario, lo que apunta a la importancia de determinar el estado de ERα de las metástasis BC¹². Para abordar esto, las guías destacan la importancia de confirmar el estado de los receptores hormonales en las lesiones metastásicas para elaborar planes de tratamiento informados^13,14. Sin embargo, la viabilidad de esto es cuestionable, particularmente a través de métodos de IHQ, considerando que pueden existir metástasis en lugares que son difíciles de tomar biopsias.

Los métodos de imagen molecular se han convertido en herramientas esenciales para la detección y visualización de lesiones tumorales en pacientes con cáncer. En particular, la tomografía por emisión de positrones (PET) requiere el uso de trazadores o, más específicamente, radiofármacos, que están diseñados para explotar ciertas características de los tumores con la intención de visualizar estas lesiones de manera no invasiva. El trazador PET más utilizado en oncología es el ¹⁸F-fluorodesoxiglucosa (¹⁸F-FDG)¹⁵. En este estudio, exploramos el uso de una forma radiomarcada de estradiol, ¹⁸F-fluoroestradiol (¹⁸F-FES). El estradiol, un ligando del ERα, es una hormona producida predominantemente por los ovarios en las mujeres¹⁶. ¹⁸F-FES recibió recientemente la aprobación de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) y se comercializa como Cerianna^TM. Este agente de diagnóstico por imágenes está diseñado para usarse como complemento de biopsias en pacientes con BC¹⁷ recurrente o metastásico. La PET de cuerpo entero con ¹⁸F-FES se puede utilizar como un método no invasivo para detectar los niveles de ERα tanto en el tumor primario como en metástasis a distancia en regiones de las que es difícil obtener biopsias¹⁸. La predicción de los niveles de ERα utilizando imágenes PET de ¹⁸F-FES se correlaciona con los resultados de IHQ y, además, la poca o ninguna detección de ERα utilizando imágenes PET de ¹⁸F-FES es un predictor fiable de tumores que es poco probable que respondan a la terapia hormonal¹⁸. Para asegurar el uso adecuado de ¹⁸F-FES en la clínica, se han formulado guías consensuadas por expertos en el tema¹⁹. En este estudio, evaluamos el uso de ¹⁸F-FES PET en modelos preclínicos de cáncer de mama en ratones.

Todos los estudios en animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Hospital de Austin (A2023/05812) y se llevaron a cabo de conformidad con el Código Australiano para el cuidado y uso de animales con fines científicos.

1. Preparación de la célula

1. Utilizando procedimientos de cultivo celular de rutina, mantenga las células MDA-MB-231 y MCF-7 en DMEM/F-12 suplementadas con penicilina/estreptomicina y 10% de suero fetal bovino (FBS) en matraces de cultivo de tejidos T175. Antes de preparar las células para la inyección, pase las células al menos 3 veces después de la reactivación de las reservas de nitrógeno líquido. Cultive las células en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO₂.
2. Propagar las células de tal manera que el día de la preparación de las células para la inyección, haya 3 × 10⁶ células MCF-7 por inyección por ratón para 15 ratones (es decir, al menos 45 × 10⁶ células MCF-7) y 1 × 10⁶ células MDA-MB-231 por inyección por ratón para 5 ratones (es decir, al menos 5 × 10⁶ células MDA-MB-231).
   NOTA: Para permitir un número igual de células en cada ratón, prepare suficientes células para cinco inyecciones adicionales (por ejemplo, prepare suficientes células para 10 inyecciones para inyectar cinco ratones).
3. El día de la inyección de células, retire los medios de todos los matraces y coloque aproximadamente 5 ml de tripsina-EDTA (0,25% de tripsina y 0,05% de EDTA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x (pH 7,4) sobre las células para facilitar el desprendimiento de las células.
4. Una vez que las células se hayan desprendido, coloque aproximadamente 10 mL de medio completo en matraces para inhibir la actividad de la tripsina. Vuelva a suspender las células y transfiera la suspensión unicelular a un tubo de 50 ml. Centrifugar a ~ 300 × g durante 2 min para pellets celdas.
5. Vuelva a suspender el gránulo de celdas en un volumen adecuado de medios y cuente las células para determinar el número total de células recolectadas.
   NOTA: Trate de contar soluciones de aproximadamente 1 × 10⁶ células por ml (50-100 células por 16 cuadrados si usa una cámara de conteo). Para las células que crecen a 5 × 10⁶ por matraz lleno, coseche las células en 5 mL de medio. Para líneas celulares con mayor densidad, use 10 mL de medio por matraz.
6. Realice este paso con hielo en una cabina de flujo laminar estéril. Una vez alcanzado este número, centrifugar la suspensión celular nuevamente a 300 × g durante 2 min para pellets celdas. Vuelva a suspender el pellet en una solución fría de PBS y una solución de matriz de membrana basal helada de modo que por cada 3 × 10⁶ células MCF-7, haya 40 μL de PBS y 10 μL de solución de matriz de membrana basal.
7. Vuelva a suspender el pellet de celda MDA-MB-231 con los mismos constituyentes, de modo que por 1 × 10⁶ células, haya 40 μL de PBS y 10 μL de solución de matriz de membrana basal. Transfiera la mezcla de matriz de membrana basal de PBS del tubo de 50 ml a tubos más pequeños de 1,5 ml con una punta de pipeta fría y mantenga la mezcla de células en hielo justo antes de la inyección de células en ratones.
   NOTA: La matriz de membrana basal utilizada en este estudio se almacena a -20 °C. El día antes de que se requiera la solución de matriz de membrana basal, se coloca una alícuota de la solución a 4 °C para descongelarla durante la noche. Al día siguiente, está listo para su uso a temperaturas frías (sobre hielo). Al pipetear la solución, asegúrese de que las puntas de pipeta utilizadas estén frías para evitar que la solución de la matriz de membrana basal se solidifique. Es una buena práctica guardar una caja de puntas de pipeta estériles en el refrigerador antes del día de la preparación de la célula para la inyección. Al resuspender el pellet de la célula en una solución de matriz de membrana basal y PBS helada, primero se agrega PBS, seguido de la cantidad requerida de solución de matriz de membrana basal.

2. Inyección celular en ratones ovariectomizados

1. Permita que los ratones desnudos BALB/c hembras ovariectomizados de 6 a 8 semanas de edad se aclimaten en las instalaciones de alojamiento de animales durante al menos 1 semana antes de la inyección de células.
   NOTA: Este estudio tuvo acceso a ratones mayores de 12 a 14 semanas de edad. La ovariectomía asegura niveles bajos de estradiol endógeno y reduce la competencia con el ligando ¹⁸F-FES. Dependiendo del modelo que se esté estudiando, es posible que los ratones más jóvenes (por ejemplo, 4-8 semanas) no necesiten someterse a una ovariectomía debido a los niveles más bajos de estradiol^{endógeno 20,21}.
2. Inducir la anestesia en un ratón con isoflurano al 4% y oxígeno a una tasa de 4 L/min utilizando una cámara de inducción de anestesia. Observe el ratón y compruebe si hay pérdida del reflejo de enderezamiento. Una vez que ya no se muevan, transfiera el ratón a una cabina de flujo laminar estéril, coloque el hocico en la máscara nasal y mantenga la anestesia ajustando el isoflurano al 2% y el oxígeno a una tasa de 2 L/min.
   NOTA: Anestesiar un ratón a la vez para garantizar un cuidado óptimo.
3. En el caso de las inyecciones de almohadillas de grasa intramamaria (IMF), frote la piel sobre la^4ª glándula mamaria inguinal con alcohol. Utilice una jeringa de 27 g preenfriada (con hielo) para extraer la suspensión de células frías y deje la jeringa en hielo para evitar el calentamiento/solidificación de la solución de la matriz de membrana basal antes de la inyección.
4. Con el pulgar y el índice de la mano no dominante, levante suavemente la^4ª glándula mamaria e inserte una aguja de jeringa de 27 G con la mano dominante, asegurándose de que el bisel de la aguja mire hacia arriba. Inyecte lentamente 50 μL de la suspensión celular que contiene la mezcla de solución de la matriz de la célula y la membrana basal en la almohadilla de grasa mamaria.
   NOTA: Se debe sentir una burbuja entre los dedos a medida que se inyectan las células. Compruebe si hay fugas en el lugar de la inyección.
5. Una vez completada la inyección, apague el isoflurano y mantenga el hocico del ratón en el cono de la nariz para inhalar oxígeno y recuperar la conciencia (esto debería tomar aproximadamente un minuto). Vuelva a colocar el mouse en una jaula sobre una almohadilla térmica para una recuperación óptima.
6. Para las inyecciones en el hombro, utilice el procedimiento descrito anteriormente para la inyección de IMF, la única diferencia es la ubicación de la inyección celular.
   NOTA: Alternativamente, la inyección en el hombro se puede completar sin anestesia (consulte el paso 2.7 a continuación).
7. Para la inyección en el hombro sin anestesia, sostenga y levante la piel sobre el hombro del ratón con la mano no dominante entre el pulgar y el índice, formando una "carpa" en la piel. Inyecte lentamente 50 μL de suspensión celular que contiene la solución de matriz de membrana basal de PBS con una aguja de jeringa de 27 G. Retire suavemente la aguja y compruebe si hay fugas.
   NOTA: Como alternativa, se puede utilizar una jeringa Hamilton para inyecciones de pequeño volumen para garantizar la precisión de la administración de volumen. Entre inyecciones, se usa etanol al 80% v/v para enjuagar la jeringa cuando se usan diferentes líneas celulares, y PBS se usa para enjuagar y eliminar el etanol residual de la jeringa.

3. Preparación de la solución de estradiol

1. Usando una báscula que pueda medir con precisión miligramos de una sustancia, pese 7 mg de polvo de estradiol en un tubo de 1.5 mL.
2. Añadir 700 μL de etanol al 100% en 7 mg de polvo de estradiol. Coloque el tubo de 1,5 mL en un agitador suave durante aproximadamente 1 h a temperatura ambiente (RT) o hasta que el polvo de estradiol se haya disuelto por completo.
3. Alicuota la solución a través de diez tubos de 1,5 mL, cada uno de los cuales contiene 70 μL de solución de etanol-estradiol. Coloque los tubos a -20 °C para su uso futuro.
   NOTA: Las existencias de estradiol-etanol pueden mantenerse a -20 °C durante unas 2 semanas.

4. Inyección subcutánea de solución de estradiol

1. El día en que se requiera una inyección de estradiol, prepare la siguiente mezcla fresca. Combine 630 μL de aceite de maíz como vehículo en el tubo de 1,5 mL que contiene 70 μL de la solución de etanol-estradiol. Agite la solución hasta que quede homogénea, asegurándose de que el etanol no se separe y forme una capa en la parte superior del aceite del vehículo.
   NOTA: Esto produce 700 μL de una solución de 20 μg/20 μL de aceite de maíz:etanol, 9:1. Cada ratón recibe 20 μL de esta solución. Siempre prepare una solución adicional, ya que el aceite de la mezcla tiende a adherirse al exterior de la jeringa y a los lados de un tubo de 1,5 ml debido a su viscosidad (por ejemplo, para 20 ratones, aunque 400 μL serían suficientes, hacer casi el doble de la cantidad (700 μL) proporciona suficiente margen de error).
2. Con una aguja de 29 G conectada a una jeringa de insulina, extraiga lentamente 20 μL de solución de estradiol.
   NOTA: Dado que la solución contiene 9 partes de aceite por 1 parte de estradiol-etanol, la mezcla tardará en introducirse en la jeringa.
3. Los ratones a los que se les inyectará solución de estradiol son aquellos que albergan tumores que expresan ERα y, por lo tanto, dependen del estrógeno para crecer (MCF-7 en este estudio). Los ratones que albergan tumores que no expresan ERα (MDA-MB-231 en este estudio) no reciben solución de estradiol. Coloque suavemente el ratón que se va a inyectar al frente, preferiblemente sobre una toalla, para evitar lastimarse las extremidades mientras se sujeta.
4. Con la mano no dominante, sujete al ratón sosteniendo la parte superior de su cola entre el dedo anular y el meñique. Utilice el pulgar y el índice para levantar la piel suelta cerca del cuello del ratón para formar una "carpa" en la piel para la inyección subcutánea de la solución de estradiol.
5. Mientras mantiene el ratón en esta sujeción, utilice la mano dominante para inyectar al ratón la solución de estradiol. Con el bisel de la aguja hacia arriba, empuje la aguja por debajo de la "tienda" de la piel hasta que se vea menos de la mitad de la aguja.
   NOTA: A medida que se inyecta la solución, la piel debe hincharse visiblemente.
6. Para evitar cualquier reflujo de la solución, mantenga la aguja debajo de la piel durante unos segundos. Si se produce algún reflujo, seque suavemente el área con un pañuelo de papel para eliminar la solución residual.
   NOTA: En algunos experimentos, se utilizó estradiol combinado con aceite de sésamo para administrar la hormona. El uso de aceite de sésamo como vehículo provoca una inflamación local debajo de la piel en los sitios de la inyección de estradiol. Como tal, el aceite de maíz fue elegido como vehículo para experimentos posteriores, en los que los signos de inflamación en los sitios de inyección de estradiol estaban ausentes o eran mínimos²². Consulte la discusión para obtener más detalles.
7. Después de retirar la aguja, frote suavemente el lugar de la inyección con un antiséptico tópico con un bastoncillo de algodón. Esto es para prevenir la inflamación en la superficie en el sitio de la inyección debido a la inserción/extracción de la aguja a través de la piel del ratón.
8. Inyectar a los ratones portadores de tumores que expresan ERα (MCF-7) inyecciones de estradiol por vía subcutánea 3 días antes de la inyección celular, seguidas de 5 veces por semana durante 5 semanas (Figura 1). Suspender las inyecciones de estradiol 2 días antes del día de la toma de imágenes para evitar la unión competitiva con la sonda ¹⁸F-FES a su objetivo, ERα.
   NOTA: En este estudio, se inyectó estradiol diariamente de lunes a viernes a ratones portadores de tumores MCF-7. Si se les iba a tomar una imagen la semana siguiente un miércoles, las inyecciones de estradiol continuaron el sábado y el domingo. El estradiol no se administró el lunes y el martes antes de que se tomaran imágenes de los ratones el miércoles.

5. ¹⁸imágenes F-FES PET y resonancia magnética de ratones ovariectomizados

PRECAUCIÓN: Utilice equipo de protección cuando manipule radiactividad. Siga todos los procedimientos reglamentarios aplicables cuando manipule radiactividad.

1. Pesa el ratón y registra su peso.
2. Para este estudio, se sintetizó y formuló ¹⁸F-FES en un grado clínico²³ (obtenido del Departamento de Imágenes y Terapia Molecular de Austin Health) para su uso en modelos animales. Diluir ¹⁸F-FES (109 min de vida media radiactiva) en una solución salina de etanol al 10% p/v a una concentración de inyección corregida por descomposición ajustada de aproximadamente 150-300 μCi/100 μL.
   NOTA: Una actividad específica de 1000 Ci/mmol es suficiente para la obtención de imágenes PET in vivo de ERα²⁴, y los ¹⁸F-FES recibidos tenían una actividad específica por encima de este valor basal.
3. Extraer 100 μL con una jeringa de insulina con una aguja de 29 G. Utilice un calibrador de dosis para medir y registrar la dosis y el tiempo de radiactividad. Coloque la jeringa detrás de un protector de plomo hasta el momento de la inyección.
   NOTA: Mida la cantidad de radiactividad de ¹⁸F-FES en cada dosis con un calibrador de dosis. El calibrador de dosis debe calibrarse con un material de referencia estándar, como el cesio-137, según el protocolo del fabricante. Es importante registrar el tiempo de la lectura para determinar la corrección de la decaimiento. Asegúrese de que la hora que se muestra en el calibrador coincida con la hora en la computadora que se utiliza para la adquisición de PET.
4. Para dilatar las venas de la cola para inyección intravenosa, coloque el ratón debajo de un elemento calefactor a una distancia de 30 cm durante 2 minutos. Limpie la cola con etanol al 70% p/v para desinfectar el área antes de la inyección.
5. Administre 100 μL de ¹⁸F-FES (todo el volumen de la jeringa) con una inyección en bolo a través de la vena lateral de la cola y registre el momento de la inyección. Presione el sitio de la inyección con un pañuelo desechable para detener el sangrado de la vena de la cola.
6. Mida la dosis restante en la jeringa más el tejido utilizando el calibrador de dosis y registre la medición y el tiempo. Inyecte ratones escalonados en lotes de dos para permitir el uso de imágenes mediante la multicámara.
   NOTA: Se dejará algo de sonda en la jeringa. Se prefiere el uso de jeringas de insulina en lugar de jeringas conectadas a agujas a través de cerraduras Luer debido a la disminución del volumen de dosis atrapado en la jeringa/aguja después de administrar la inyección. Además, se mide la radiactividad en el tejido que se utiliza para detener cualquier hemorragia que pueda ocurrir después de la inyección intravenosa de la sonda. Esto se debe a que el reflujo de sangre absorbido por el tejido puede contener algo de radiactividad de ¹⁸F-FES. Además, el tiempo que se tarda en calentar las venas laterales de la cola dependerá de variables como la intensidad de la fuente de calor y lo cerca que esté de los ratones. En el caso de las lámparas de calor estándar, las venas pueden tardar hasta 15 minutos en dilatarse. Los ratones deben ser monitoreados de cerca para detectar signos de sobrecalentamiento y retirados de la fuente de calor entre inyecciones si es necesario.
7. En el caso de los ratones asignados al sueño después de la inyección, coloque el ratón inyectado en la cámara de anestesia mantenida bajo un nivel de mantenimiento de isoflurano (2%-2,5%) y oxígeno (2 L/min) durante 1 h en una almohadilla térmica para permitir que la sonda se distribuya a través de la circulación sistémica del ratón antes de la exploración PET. Permita que los otros ratones del grupo caminen libremente en su jaula durante 1-1,5 horas hasta la tomografía por emisión de positrones.
8. Después de 1-1,5 h, coloque el ratón en una cámara de imágenes bajo anestesia con isoflurano en el cono de la nariz. Encienda el calefactor de cama a 32 °C, seleccione una configuración de varias cámaras y encienda el sistema de monitorización respiratoria. Coloque los dos ratones que se van a fotografiar en posición prona. Coloque la cámara de imágenes en la máquina PET/MRI.
9. Controle la respiración del ratón durante la adquisición de imágenes. Utilice una tabla de respiración para asegurarse de que haya entre 60 y 80 respiraciones por minuto en cualquier momento durante la exploración. Si la frecuencia respiratoria cae por debajo o por encima del rango deseado, ajuste la dosis de isoflurano según sea necesario.
   NOTA: La respiración del animal puede ser monitoreada debido a la presencia de un sensor en la cámara de imágenes.
10. Combine una adquisición de PET estática de 15 minutos con una resonancia magnética axial 3D con eco de gradiente (GRE). Consulte a continuación los parámetros de adquisición:
    1. Para configurar el protocolo PET, abra la ventana Editor de radiofármacos en el software correspondiente. Especifique el isótopo que se está utilizando, la actividad de la jeringa (MBq), el tiempo de inyección y la actividad aplicada (MBq) y el peso corporal. Todos estos parámetros son esenciales para ayudar a calcular y cuantificar la absorción de la sonda en el tejido de interés.
    2. Para asegurarse de que el ratón está colocado correctamente para la obtención de imágenes, utilice una secuencia de exploración 2D (frontal y trasera) para determinar el campo de visión de la PET. Proceda a una adquisición de PET estática de 15 minutos utilizando una ventana de energía de 400-600 keV, modo de coincidencia de 1-5, 5 ns. Realice una resonancia magnética axial GRE3D durante aproximadamente 27 minutos después de esto.
11. Reconstruya las imágenes adquiridas utilizando el software correspondiente.
    1. Realice la reconstrucción estática de la imagen PET/MRI y utilice el planificador geométrico para modificar el área de reconstrucción para asegurarse de que cubra la totalidad del ratón, asegurando un tiempo de reconstrucción óptimo.
    2. En la ventana Identificación de resultados , cambie correcciones aleatorias, corrección de atenuación (AC) + dispersión, rango de posición a Activado. Establezca el tiempo de referencia de decaimiento en ADMIN. Establezca el umbral de aire corporal en 30% y base la corrección de atenuación en el mapa de materiales.
12. Utilice el software adecuado para la separación de imágenes multicámara, el registro conjunto y para dibujar regiones de interés (ROI). Para el corregistro, realinee la resonancia magnética para que se ajuste a la PET y reconstruya la imagen de la PET.
13. Para separar las imágenes multicámara, haga clic en Procesamiento de imágenes > Segmentación > Separador de hoteles. Active el modo científico y ajuste los parámetros de umbral y volumen según sea necesario hasta que se encuentren 2 objetos.
14. Introduzca la dosis en el momento de la inyección después de tener en cuenta cualquier dosis residual que quede en la jeringa para convertir los datos de PET a la unidad de porcentaje de dosis inyectada por gramo (%ID/g) o, además, introduzca el peso del sujeto para convertir los datos de PET a la unidad de valor de absorción estandarizado (SUV). Para realizar esta conversión, haga clic con el botón derecho en el conjunto de datos PET y localice el campo %ID/g en la pestaña Información básica . Introduzca el %ID/g registrado anteriormente.
15. Para dibujar el retorno de la inversión en las secciones del tumor, haga clic en la pestaña Mediciones en el lado izquierdo de la ventana del programa. Dibuja el ROI con la herramienta de polígono o a mano alzada . Dibuje cuidadosamente alrededor de la circunferencia del tumor, asegurándose de que la acción se realice mientras la imagen PET está en la ventana activa (verifique con Fn-A). El resultado da un valor del ROI como %ID/g.
    NOTA: El análisis del ROI proporciona una buena estimación del %ID/g. Una cámara bien calibrada debería proporcionar una precisión del ±5% en comparación con los datos de biodistribución ex vivo .

6. Recolección y fijación de tejido tumoral para inmunohistoquímica

1. En el criterio de valoración experimental, se practica la eutanasia al ratón mediante la inhalación letal de isoflurano al 4%-5% o la inhalación excesiva de CO₂.
2. Con unas tijeras quirúrgicas y unas pinzas, haga con cuidado una pequeña incisión cerca de la superficie del tumor y reseque el tejido tumoral. Si la piel está adherida al tejido tumoral, use una hoja de bisturí para separar suavemente la piel del tumor.
3. Coloque el tejido tumoral en un vial de 5 ml que contenga aproximadamente 3 ml de formalina tamponada neutra al 10%. Asegúrese de que la totalidad del tejido esté cubierto por la solución para facilitar la fijación del tejido. Mantener el tejido sumergido en formol durante 24 h.
4. Al día siguiente, transfiera el tejido tumoral fijado a un vial de 5 ml que contenga etanol al 70%. Etiquete un casete de tejido específico para el tejido tumoral en preparación para la inclusión en parafina.
5. Coloque el tejido tumoral en un casete de papel y guárdelo en una solución de etanol al 70% hasta la inclusión en parafina.
   NOTA: En este estudio, la inclusión de parafina fue realizada por patólogos anatómicos de Austin Health.

7. Inmunohistoquímica para la detección del receptor de estrógeno alfa (ERα)

1. Con un micrótomo, corte secciones de 4 μm de grosor del tejido tumoral necesario para la tinción, siguiendo los procedimientos estándar.
2. Coloque los portaobjetos de microscopio de vidrio con secciones tumorales cortadas en una rejilla de portaobjetos y coloque la rejilla en un horno a 37 °C para que se seque durante la noche y para asegurarse de que los tejidos se adhieran a los portaobjetos antes de teñir.
3. A la mañana siguiente, coloque la rejilla con portaobjetos que contengan secciones tumorales cortadas en un horno a 60 °C durante 30 minutos para facilitar el proceso de desparafinado.
   NOTA: Los portaobjetos de vidrio deben mirar hacia arriba mientras se hornea. Esto asegura la adherencia del tejido, y cualquier cera que se derrita se derrite en su propio portaobjetos en lugar de en los portaobjetos adyacentes.
4. Para rehidratar las secciones, sumerja las secciones horneadas en xileno dos veces, 5 min cada una (2x 5 min) de etanol al 100% durante 2 x 5 min y luego etanol al 70% durante 1x 5 min. Lave los portaobjetos en agua destilada durante 5 min.
5. Para la recuperación de antígenos, sumergir los portaobjetos en un recipiente con 1x tampón EDTA, pH 8, durante 25-30 min en un baño de agua a 100 °C. Retire los portaobjetos del baño de agua y deje que los portaobjetos se asienten en RT durante al menos 1 hora. Una vez que los portaobjetos se hayan enfriado, lávelos con agua corriente del grifo durante 2 minutos y luego TBST (TBS con 0.01% Tween20) durante 2 x 5 minutos.
6. Con un bolígrafo barrera hidrofóbico, dibuja un círculo alrededor de las secciones de las diapositivas.
7. Apague las peroxidasas endógenas colocando aproximadamente 100 μL de solución de H₂O₂ al 3% (diluida en agua destilada) en secciones durante 10 min en RT. Lave los portaobjetos en agua corriente del grifo durante 2 min y luego TBST durante 2x 5 min.
8. Bloquear secciones con aproximadamente 100 μL/sección de tampón bloqueante (5% de albúmina sérica bovina (BSA) en TBST) durante 30 min en RT.
9. Drene el tampón de bloqueo moviendo suavemente el exceso de solución en la bandeja de incubación. Añadir aproximadamente 100 μL de anticuerpo primario (anti-ERα humano criado en conejo) a las secciones con una dilución de 1:300 (o con una dilución óptima predeterminada específica para el anticuerpo utilizado). Prepare diluciones de anticuerpos en BSA TBST al 1% y coloque portaobjetos para incubar con el anticuerpo a 4 °C durante la noche.
   NOTA: La bandeja de incubación debe llenarse con agua en la parte inferior para garantizar que las secciones no se sequen durante la noche.
10. A la mañana siguiente, lave los portaobjetos con TBST durante 3 x 5 min. Añadir aproximadamente 100 μL de anticuerpo secundario anti-conejo en las secciones y dejar actuar durante 45 min en RT. Lave los portaobjetos con TBST durante 3 x 5 min.
11. En una campana extractora, agregue aproximadamente 100 μL de reactivo de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) en las secciones y mantenga la solución durante aproximadamente 3 minutos por sección. Inhiba la reacción DAB lavando los portaobjetos con agua corriente del grifo durante 10 minutos.
12. Frote los portaobjetos con hematoxilina durante 1 minuto y enjuague con agua corriente del grifo durante 2 minutos. Sumerja los portaobjetos en el agua de Scott durante 1 minuto, luego enjuague con agua corriente del grifo durante otros 2 minutos.
13. Para deshidratar las secciones, sumerja las secciones en etanol al 70% durante 2 minutos, etanol al 100% durante 2 x 2 minutos y luego xileno durante 2 x 2 minutos.
14. En una campana extractora, monte cuidadosamente las secciones en poliestireno xileno (DPX) de ftalato de dibutilo y coloque un cubreobjetos sobre las secciones, asegurándose de que no queden burbujas atrapadas sobre el tejido de interés. Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche en la campana extractora.
15. Al día siguiente, use un escáner de portaobjetos para capturar imágenes y visualizar la mancha.

Para determinar la localización en la que se pueden visualizar claramente los tumores ERα positivos utilizando ¹⁸F-FES PET, se utilizaron tres cohortes de ratones ovariectomizados (Figura 1). A dos grupos de ratones se les inyectaron células MCF-7, una línea celular de cáncer de mama ERα positiva, ya sea IMF o en el hombro. Como control negativo, a otra cohorte de ratones se les inyectaron células MDA-MB-231, una línea celular de cáncer d...

En este trabajo describimos la utilidad de la PET/RM ¹⁸F-FES en la detección de tumores de mama caracterizados por la expresión de ERα. A modo de ejemplo, demostramos que un lugar en el que se pueden visualizar los tumores ERα positivos es en el hombro de los ratones: estos tumores se pueden identificar claramente por la absorción de ¹⁸F-FES, en comparación con los tumores ubicados dentro de la^4ª almohadilla de grasa mamaria inguinal (

Los autores no tienen nada que revelar.

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional del Cáncer de Mama (IIRS-22-071). Reconocemos el programa de Apoyo a la Infraestructura Operativa del Gobierno del Estado de Victoria. Esta investigación también se llevó a cabo utilizando el Solid Target Laboratory, una asociación ANSTO-Austin-LICR, también respaldada por el Centro Nacional de Imágenes y el Gobierno de Victoria. Los autores agradecen la asistencia científica y técnica del National Imaging Facility, una capacidad de la Estrategia Nacional de Infraestructura de Investigación Colaborativa (NCRIS), en el nodo La Trobe-ONJCRI, Instituto de Investigación del Cáncer Olivia Newton-John (ONJCRI). Las figuras 1 y 3 se han realizado con BioRender.