Kültürlenmiş Kemik Hücrelerinde Yağ Asidi Oksidasyonunun Değerlendirilmesi

Mevcut protokol, birincil kemik hücrelerinin veya ilgili hücre hatlarının kültürlerinde yağ asidi oksidasyon kapasitesini değerlendirmek için bir testi tanımlar.

Osteoblastları farklılaştırarak kemik oluşumunun, bu özel hücrelerin kemik dokusunu oluşturan büyük hücre dışı matris proteinlerini sentezlemesi ve daha sonra mineralizasyonu için gerekli iyonları konsantre etmesi gerektiğinden, önemli miktarda enerjik girdi gerektirmesi beklenir. Kemik oluşumunun metabolik gereksinimleri ile ilgili veriler hızla ortaya çıkmaktadır. Öğrenilecek çok şey olsa da, ara metabolizmadaki bozuklukların iskelet hastalığına katkıda bulunması beklenmektedir. Burada, osteoblastik hücrelerin ¹⁴C etiketli yağ asidini ¹⁴CO₂ ve asitte çözünür metabolitlere oksitleme kapasitesini değerlendirmek için bir protokol özetlenmiştir. Yağ asitleri, beslendikten sonra veya yağ dokusu depolarından serbest bırakıldıktan sonra dolaşımdan alınabilen zengin bir enerji rezervini temsil eder. T-25 doku kültürü şişelerinde gerçekleştirilen test, yağ asidi kullanımı üzerindeki gen kazancı veya fonksiyon kaybının incelenmesi ve kemik kütlesinin korunması için gerekli büyüme faktörleri veya morfojenler şeklinde anabolik sinyallerin etkisi için yararlıdır. Glikoz veya glutamin gibi amino asitlerin oksidasyonunu değerlendirmek için protokolü uyarlama yeteneği ile ilgili ayrıntılar da sağlanmaktadır.

Kemik iliğinde ve periosteumda bulunan progenitör hücrelerden türetilen osteoblast, kemik dokusunu oluşturan mineralize, kollajen açısından zengin matrisin sentezlenmesinden ve salgılanmasından sorumludur. Bu enerjik olarak pahalı çabayı yerine getirmek ve iskelet bütünlüğünün yaşam boyu korunmasına katkıda bulunmak için, bu özel hücreler, hücre dışı matris proteinlerini ^1,2 sentezlemek için gerekli olan bol miktarda kaba endoplazmik retikulum ve yakıt substratlarından gerekli kimyasal enerjiyi toplamak için çok sayıda yüksek zar potansiyelli mitokondriyi^{korur 3,4}. Bu ikinci işlevin önemi, kemik büyümesinin durması ve kalori kısıtlamasında olduğu gibi enerji eksiklikleri ile ilişkili osteopeni ^5,6'nın gelişmesi ile örneklenmektedir. Osteoblastın tercih ettiği yakıt kaynağının kimliği ve farklılaşma sırasında veya anabolik sinyalizasyona yanıt olarak osteoblastın metabolik gereksinimlerine ilişkin veriler ortaya çıkmaktadır ^7,8.

Uzun zincirli yağ asitleri, serumda bulunan ve azalan kalori alımına veya artan enerji harcamasına yanıt olarak yağ dokusundan salınan zengin bir kimyasal enerji kaynağını temsil eder. Hücre zarını geçtikten ve çözünürlüğü artırmak için Koenzim A'ya bağlandıktan sonra, yağlı asil-CoA'lar, dış ve iç mitokondriyal zarlar ve karnitin-asilkarnitin translokaz⁷ üzerindeki ikili karnitin palmitoiltransferaz enzimleri tarafından mitokondriyal matrise taşınır. Mitokondriyal matris içinde, β-oksidasyon makine zinciri, TCA döngüsüne (trikarboksilik asit döngüsü) giren asetil-CoA üreten ve eşdeğerlerini indirgeyen 4 aşamalı bir süreçte asil-CoA'yı kısaltır. Hayvanlarda en sık görülen yağ asitleri olan palmitatın (C₁₆) katabolizması, bu yol yoluyla ~ 131 ATP, glikoz oksidasyonu tarafından üretilen ~ 38 ATP'den önemli ölçüde daha fazla^{verir 7}.

Radyoaktif işaretli lipitler kullanılarak yapılan izleme çalışmaları, kemiğin dolaşımdaki lipitlerin önemli bir kısmını aldığını ^9,10, lipid katabolizması için kritik olan enzimlerin genetik ablasyonunun osteoblast aktivitesinde ve kemik kaybında bir azalmaya yol açtığını^{göstermiştir 9,11}. Burada sunulan protokol, kültürlenmiş osteoblastların yağ asitlerini oksidasyon sürecindeki ara adımları temsil eden CO₂ veya asitte çözünür metabolitlere tamamen metabolize etme kapasitesini değerlendirmek için ¹⁴C etiketli bir yağ asidi kullanır. Radyoaktivite kullanımı gerekli olsa da, yöntem basittir, sınırlı yatırım gerektirir ve diğer radyoaktif işaretli metabolitlerin ve hücre tiplerinin yararına uyarlanabilir.

Bu protokol, yağ asidi oksidasyon kapasitesinin bir göstergesi olarak [^1-14C]-oleik asidin ¹⁴CO_2'ye dönüştürülmesini kullanır. Yerel Radyasyon Güvenliği ofisi, deneylere başlamadan önce radyoaktif malzemelerin kullanımına ilişkin protokolü onayladı. Tüm radyasyon prosedürleri, uygun kişisel koruyucu ekipman kullanılarak bir pleksiglas kalkan arkasında gerçekleştirildi. Yerel Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi, birincil hücreleri kullanmadan önce protokolü onayladı.

1. Kültürlenmiş osteoblastlarda yağ asidi oksidasyonu

1. Primer kalvarial osteoblastları¹² veya Mc3t3-E1 gibi bir osteoblastik hücre hattını ve %10 fetal sığır serumu, 100 U/mL penisilin ve 0.1 μg/mL streptomisin içeren α-MEM'de T-25 şişelerinde (5 x 10⁵ hücre / şişe) plakayı alt kültürleyin.
   1. Deneyde kullanılmak üzere her tedavi grubu için (yani kontrol ve gen nakavt veya araç ve farmakolojik tedavi) tohum 3-4 şişe. Hücre sayısına veya protein konsantrasyonlarına normalleşmek için her tedavi grubu için ek 1-2 şişe tohumlayın. Kültür şişelerini, 37 ° C'de% 5 CO₂ ile nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.
2. Şişeler birleşene kadar hücreleri 2-3 gün kültürleyin. Kültür ortamına 50 μg / mL Askorbik asit ve 10 mM β-gliserol fosfat (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek birleşik kültürlerin farklılaşmasını sağlayın ve kültüre 14 güne kadar devam edin.
   NOT: Büyüme faktörü tedavileri planlanıyorsa gece boyunca serum açlığı (% 0.5 -% 1 FBS ekleyerek) gereklidir. FBS yüzdesinin düşürülmesi, kültürdeki radyoaktif işaretli olmayan lipitlerin miktarını sınırlar ve eksojen büyüme faktörlerinin maksimum etkisine izin verir. Hormonların etkileri test edilecekse, kömürden sıyrılmış FBS kullanılır.
3. Deneyden bir gün önce filtre kağıdını, 15 mm x 30 mm lastik kılıf tıpalarını ve polipropilen merkez kuyularını ( Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın.
   1. 1 cm x 10 cm'lik bir filtre kağıdı şeridini fan şeklinde katlayın ve polipropilen merkez kuyusunun kovasına yerleştirin. Polipropilen merkezinin kolunu lastik manşon durdurucunun ortasından iyice bastırın ve polipropilen merkezini T-25 şişesine iyice indirin. Ardından şişeyi manşon tıpa ile kapatın (Şekil 1).
      NOT: Kültür ortamı ile temas etmemesini sağlamak için polipropilen merkezinin yerleşimini iyi ayarlamak gerekebilir. Deney sırasında, polipropilen merkez kuyusu, filtre kağıdının etiketleme ortamına temas etmesini önler ve ¹⁴CO₂ toplanmasına izin verir.
4. Deney gününde,% 20 sığır serum albüminini fosfat tamponlu salin içinde (şişe başına 5 μL) 0.1 μCi / mL [^1-14C] -oleik asit (0.6 μL / şişe) ile karıştırarak [1-14 C] oleik asidi sığır serum albüminine (BSA) eşlenik hale getirin 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde.
   1. Daha sonra tüpü 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin ve hafifçe çalkalayarak 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Pipetleme hatasını hesaba katmak için oleik Asit-BSA konjugatları için 1-2 ekstra şişe hazırlayın.
5. Kültür ortamını doku kültürü şişesinden çıkarın ve 1.5 mL taze serum açlık ortamı ile değiştirin (adım 1.2).
6. Her şişe için, bir etiketleme çözeltisi üretmek için 5.6 μL oleik Asit-BSA çözeltisini (adım 1.4) 2 μL 100 mM karnitin çözeltisi ve 1 mL kültür ortamı ile birleştirin. Etiketleme çözeltisini kültür şişelerine ekleyin. Teste eklenen toplam aktivite sayısını okumak için fazla çözeltiyi saklayın.
   NOT: Etiketleme çözeltisi, hücresel sayıyı veya protein konsantrasyonunu ölçmeyi amaçlayan ekstra şişelere eklenmez.
7. Şişedeki filtre kağıdını içeren polipropilen merkez kuyularını indirin ve ardından lastik tıpa ile kapatın.
   NOT: Polipropilen merkez kuyusunun kültür ortamı ile temas etmemesi çok önemlidir. Bu, filtre kağıdının CO₂ yerine radyoaktif işaretli yağ asidi ile çapraz kontaminasyonuna yol açacaktır.
8. Hücre kültürlerini 37 ° C'de% 5 CO₂ ile 3 saat inkübe edin.
9. ¹⁴CO₂ toplamak için, filtre kağıdını ıslatmak için polipropilen merkez kuyucuğuna 150 μL 1 N NaOH ve kültür ortamına 200 μL 1 M perklorik asit enjekte edin. Kauçuk tıpadan bir iğne iterek NaOH ve perklorik asidi enjekte edin.
   NOT: Lastik tıpa şişeden çıkarılmamalıdır. Bu, ¹⁴CO_2'nin kaçmasına neden olabilir. Enjeksiyonun kolaylığı için, şişeyi dik konumda tutun ve enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra kültür konumuna geri dönün.
10. Şişeleri 55 °C'de 1 saat inkübe edin.
11. Şişeleri hücre kültürü davlumbazında soğuttuktan sonra açın. Filtre kağıtlarını polipropilen merkez kuyucuklarından cımbızla çıkarın ve bir sintilasyon şişesindeki 3-4 mL sintilasyon sıvısına (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
    NOT: Toplam aktivite sayımını ölçmek için 3-4 mL sintilasyon sıvısına 100 μL fazla etiketleme çözeltisi eklenir. Arka plan aktivitesini ölçmek için 3-4 mL sintilasyon sıvısına 100 μL bazal kültür ortamı ([1-14 C]-oleik asit olmadan) eklenir.
12. Oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca inkübe ettikten sonra, bir sintilasyon sayacı kullanarak radyoaktiviteyi dakikadaki sayım (cpm) cinsinden ölçün (bkz.
13. CPM sonuçlarını normalleştirmek için, her kültür koşulu için etiketlenmemiş T-25 şişelerinden protein ekstraktlarını izole edin. 5 mL fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın, her şişeye 1 mL RIPA hücre lizis tamponu ekleyin ve hücre yüzeyini bir hücre sıyırıcı ile kazıyın.
    1. RIPA tamponunu bir pipet ile bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 19.000 x g'da 4 ° C'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı bir pipetle taze bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve BCA test protokolüne göre protein konsantrasyonunu belirleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
    2. Üretilen ¹⁴_CO2'nin normalleştirilmiş cpm'sini elde etmek için sintilasyon sayacından okunan ham cpm'yi protein konsantrasyonuna bölün (Tablo 1).
14. Sintilasyon şişelerini, hücre kültürü malzemelerini, ortamı, şırıngaları vb. atmak için yerel gereksinimleri izleyin. Çalışma yüzeylerini dekontamine edin ve yerel gerekliliklere göre radyoaktivite silme testleri yapın.

2. Asitte çözünür metabolit toplama

NOT: Yukarıdaki adım 1.8'de kullanılan 3 saatlik inkübasyon süresi, hücreler tarafından alınan tüm [^1-14C] tam oleik asidi CO_2'ye oksitlemek için yeterli zaman olmayabilir. Yağ asidi oksidasyon yolundaki akı, asitte çözünür fraksiyondaki radyoaktivite ölçülerek de değerlendirilebilir.

1. İşlem görmüş her T-25 şişesinden 1 mL asitlenmiş ortam toplayın ve 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
2. 60 μL %20 BSA ve 100 μL 16 M perklorik asit ekleyin.
3. Girdap yapın ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
4. Ardından, 4 ° C'de 30 dakika boyunca 20.000 x g'da girdap yapın ve santrifüjleyin.
5. Sintilasyon sıvısına 200 μL süpernatan ekleyin ve aktiviteyi ölçün (adım 1.12).
6. Okumaları protein konsantrasyonuna veya DNA ölçümlerine göre normalleştirin (adım 1.13.1).

3. Glikoz oksidasyonu veya amino asit oksidasyonunun ölçülmesi

1. Bu yakıt moleküllerinin oksidasyonunu ölçmek için ¹⁴C etiketli oleik asidi ¹⁴C etiketli glikoz veya ¹⁴C etiketli amino asit ile değiştirin.
2. Osteoblast kültürlerini adım 1.1-1.2'ye göre hazırlayın.
3. Deneyi başlatmak için, kültür ortamını doku kültürü şişesinden çıkarın ve 1.5 mL taze serum açlık ortamı ile değiştirin.
4. 1 mL açlık ortamında 0.6 μCi, ¹⁴C etiketli glikoz veya ¹⁴C etiketli amino asitten oluşan bir etiketleme çözeltisi hazırlayın ve şişelere ekleyin.
5. 1.6-1.13 adımlarını gerçekleştirin.

Mitokondriyal uzun zincirli yağ asidi oksidasyonu için hem karnitin palmitoiltransferaz-1 (Cpt1) hem de karnitin palmitoiltransferaz-2'nin (Cpt2) enzimatik aktivitesi gereklidir. Cpt1, metabolik yoldaki hız sınırlayıcı enzimdir, ancak memeli genomlarında üç izoform (Cpt-1a, Cpt-1b ve Cpt-1c) kodlanmıştır ve bir izoformun genetik bozulması, başka bir izoform^13'ün telafi yukarı regülasyonuna yol açabilir. Buna karşılık, Cpt2 tek bir gen tarafı...

Yukarıda açıklanan prosedür, ölçülen çıktılar NaOH ile ıslatılmış filtre kağıdı üzerinde toplanan ¹⁴CO₂ ve kültürün perklorik asit ile asitleştirilmesinden sonra toplanan asitte çözünür metabolitler olduğundan, yağ asidi oksidasyonunun doğrudan değerlendirilmesine izin verir. Floresan etiketli lipid molekülleri veya lipid analogları kullanan ticari olarak temin edilebilen tahlil kitleri, lipid alımını ölçebilir, ancak enerji üre...

Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.

Bu çalışma, Gazi İşleri Araştırma ve Geliştirme Ofisi (BX003724) Biyomedikal Laboratuvar Araştırma ve Geliştirme Hizmetinden bir Başarı İnceleme Ödülü ve Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü'nden (DK099134) bir hibe ile desteklenmiştir.