Bewertung der Fettsäureoxidation in kultivierten Knochenzellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt einen Assay zur Beurteilung der Fähigkeit zur Fettsäureoxidation in Kulturen von primären Knochenzellen oder relevanten Zelllinien.

Es wird erwartet, dass die Knochenbildung durch Differenzierung von Osteoblasten einen erheblichen Energieaufwand erfordert, da diese spezialisierten Zellen große extrazelluläre Matrixproteine synthetisieren müssen, aus denen das Knochengewebe besteht, und dann die für seine Mineralisierung notwendigen Ionen konzentrieren müssen. Daten über die metabolischen Anforderungen der Knochenbildung gibt es in rasantem Tempo. Obwohl es noch viel zu lernen gibt, wird erwartet, dass Störungen im intermediären Stoffwechsel zu Skeletterkrankungen beitragen. In dieser Arbeit wird ein Protokoll zur Bewertung der Fähigkeit osteoblastischer Zellen zur Oxidation von ¹⁴C-markierten Fettsäuren zu ¹⁴CO₂ und säurelöslichen Metaboliten vorgestellt. Fettsäuren stellen eine reichhaltige Energiereserve dar, die nach der Fütterung oder nach ihrer Befreiung aus den Fettgewebespeichern aus dem Kreislauf aufgenommen werden kann. Der Assay, der in T-25-Gewebekulturkolben durchgeführt wird, ist hilfreich für die Untersuchung des Gengewinns oder -verlusts auf die Fettsäureverwertung und die Wirkung anaboler Signale in Form von Wachstumsfaktoren oder Morphogenen, die für die Erhaltung der Knochenmasse notwendig sind. Details zur Möglichkeit, das Protokoll anzupassen, um die Oxidation von Glukose oder Aminosäuren wie Glutamin zu beurteilen, werden ebenfalls bereitgestellt.

Der Osteoblast, der aus Vorläuferzellen gewonnen wird, die im Knochenmark und im Periost vorhanden sind, ist für die Synthese und Sekretion der mineralisierten, kollagenreichen Matrix verantwortlich, aus der das Knochengewebe besteht. Um dieses energetisch teure Unterfangen zu erfüllen und zur lebenslangen Aufrechterhaltung der Integrität des Skeletts beizutragen, unterhalten diese spezialisierten Zellen ein reichlich vorhandenes raues endoplasmatisches Retikulum, das für die Synthese extrazellulärer Matrixproteine^{unerlässlich ist 1,2} und zahlreiche Mitochondrien mit hohem Membranpotential, um die erforderliche chemische Energie aus Brennstoffsubstraten zu gewinnen ^3,4. Die Bedeutung dieser letztgenannten Funktion wird durch die Beendigung des Knochenwachstums und die Entwicklung von Osteopenie ^5,6 veranschaulicht, die mit Energiedefiziten wie der Kalorienrestriktion verbunden ist. Die Identität der bevorzugten Brennstoffquelle des Osteoblasten und die Daten über den metabolischen Bedarf des Osteoblasten während der Differenzierung oder als Reaktion auf anabole Signalwege zeichnen sich ab ^7,8.

Langkettige Fettsäuren stellen eine reichhaltige Versorgung mit chemischer Energie dar, die im Serum vorhanden ist und aus dem Fettgewebe als Reaktion auf eine verminderte Kalorienaufnahme oder einen erhöhten Energieverbrauch freigesetzt wird. Nach dem Durchlaufen der Zellmembran und der Ligation an Coenzym A zur Erhöhung der Löslichkeit werden fetthaltige Acyl-CoAs durch die dualen Carnitin-Palmitoyltransferase-Enzyme auf der äußeren und inneren Mitochondrienmembran und die Carnitin-Acylcarnitin-Translokase⁷ in die mitochondriale Matrix transportiert. Innerhalb der mitochondrialen Matrix verkürzt die Kette der β-Oxidationsmaschinerie Acyl-CoA in einem 4-stufigen Prozess, der Acetyl-CoA erzeugt, das in den TCA-Zyklus (Tricarbonsäurezyklus) eintritt und Äquivalente reduziert. Der Katabolismus von Palmitat (C₁₆), den häufigsten Fettsäuren bei Tieren, liefert über diesen Weg ~131 ATP, wesentlich mehr als das durch Glukoseoxidation erzeugte ~38 ATP⁷.

Rückverfolgungsstudien mit radioaktiv markierten Lipiden zeigten, dass Knochen einen signifikanten Anteil der zirkulierenden Lipide aufnehmen ^9,10, während die genetische Ablation von Enzymen, die für den Lipidabbau entscheidend sind, zu einer Verringerung der Osteoblastenaktivität und des Knochenverlusts führt ^9,11. Das hier vorgestellte Protokoll verwendet eine ¹⁴C-markierte Fettsäure, um die Fähigkeit kultivierter Osteoblasten zu bewerten, Fettsäuren vollständig zu CO₂ oder säurelöslichen Metaboliten zu metabolisieren, die Zwischenschritte im Oxidationsprozess darstellen. Obwohl die Verwendung von Radioaktivität erforderlich ist, ist die Methode einfach, erfordert begrenzte Investitionen und ist zum Nutzen anderer radioaktiv markierter Metaboliten und Zelltypen anpassbar.

Dieses Protokoll verwendet die Umwandlung von [^1-14C]-Ölsäure in ¹⁴CO₂ als Indikator für die Oxidationskapazität von Fettsäuren. Das örtliche Strahlenschutzamt genehmigte das Protokoll für die Verwendung radioaktiver Stoffe, bevor es mit den Experimenten begann. Alle Bestrahlungsverfahren wurden hinter einer Plexiglasscheibe mit entsprechender persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt. Das örtliche Komitee für Tierpflege und -verwendung genehmigte das Protokoll vor der Verwendung von Primärzellen.

1. Fettsäureoxidation in kultivierten Osteoblasten

1. Subkultur der primären kalvarialen Osteoblasten¹² oder einer osteoblastischen Zelllinie wie Mc3t3-E1 und Platte in T-25-Kolben (5 x 10⁵ Zellen/Kolben) in α-MEM, die 10 % fötales Rinderserum, 100 μg/ml Penicillin und 0,1 μg/ml Streptomycin enthalten.
   1. Säen Sie 3-4 Kolben für jede Behandlungsgruppe (d. h. Kontrolle und Gen-Knockout oder Vehikel und pharmakologische Behandlung) zur Verwendung im Versuch. Säen Sie zusätzliche 1-2 Kolben für jede Behandlungsgruppe, um sich auf die Zellzahl oder Proteinkonzentrationen zu normalisieren. Inkubieren Sie die Kulturkolben in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂.
2. Kultivieren Sie die Zellen 2-3 Tage lang, bis die Kolben konfluieren. Induzieren Sie die konfluenten Kulturen zur Differenzierung, indem Sie 50 μg/ml Ascorbinsäure und 10 mM β-Glycerinphosphat (siehe Materialtabelle) zu den Nährmedien geben und die Kultur für bis zu 14 weitere Tage fortsetzen.
   HINWEIS: Ein Serummangel (Zugabe von 0,5 % bis 1 % FBS) über Nacht ist erforderlich, wenn Wachstumsfaktorbehandlungen geplant sind. Die Verringerung des FBS-Anteils begrenzt die Menge an nicht radioaktiv markierten Lipiden in der Kultur und ermöglicht die maximale Wirkung exogener Wachstumsfaktoren. Wenn die Wirkung von Hormonen getestet werden soll, wird mit Holzkohle abgestreiftes FBS verwendet.
3. Bereiten Sie das Filterpapier, die 15 mm x 30 mm großen Gummimanschettenstopfen und die Mittelvertiefungen aus Polypropylen (siehe Materialtabelle) am Tag vor dem Experiment vor.
   1. Falten Sie einen 1 cm x 10 cm großen Streifen Filterpapier in Form eines Fächers und legen Sie ihn in den Eimer der Polypropylen-Mulde. Drücken Sie den Arm der Polypropylen-Mitte gut durch die Mitte des Gummimanschettenstopfens und senken Sie die Polypropylen-Mitte gut in den T-25-Kolben ab. Dann verschließen Sie den Kolben mit dem Hülsenstopfen (Abbildung 1).
      HINWEIS: Es kann erforderlich sein, die Platzierung des Polypropylen-Zentrums gut anzupassen, um sicherzustellen, dass es nicht mit dem Nährmedium in Berührung kommt. Während des Versuchs verhindert die Polypropylen-Vertiefung, dass das Filterpapier das Etikettiermedium berührt, und ermöglicht die Sammlung von ¹⁴CO₂.
4. Am Tag des Versuchs wird [^1-14C]-Ölsäure an Rinderserumalbumin (BSA) konjugiert, indem 20 % Rinderserumalbumin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (5 μl pro Kolben) mit 0,1 μCi/ml [^1-14C]-Ölsäure (0,6 μl/Kolben) in einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen gemischt werden.
   1. Legen Sie dann das Röhrchen in ein konisches 50-ml-Röhrchen und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 37 °C unter leichtem Schütteln. Bereiten Sie 1-2 zusätzliche Flaschen für Ölsäure-BSA-Konjugate vor, um Pipettierfehler zu vermeiden.
5. Das Nährmedium aus dem Gewebekulturkolben nehmen und durch 1,5 ml frisches Serum-Hungermedium ersetzen (Schritt 1.2).
6. Für jeden Kolben werden 5,6 μl Ölsäure-BSA-Lösung (Schritt 1.4) mit 2 μl 100 mM Carnitinlösung und 1 ml Nährmedium kombiniert, um eine Markierungslösung herzustellen. Geben Sie die Markierungslösung in die Kulturflaschen. Bewahren Sie die überschüssige Lösung auf, um die Gesamtzahl der dem Assay hinzugefügten Aktivitäten abzulesen.
   HINWEIS: Die Markierungslösung wird nicht in die zusätzlichen Kolben gegeben, die zur Quantifizierung der Zellzahl oder der Proteinkonzentration bestimmt sind.
7. Senken Sie die Mittelvertiefungen aus Polypropylen, die das Filterpapier enthalten, in den Kolben ab und verschließen Sie ihn dann mit dem Gummistopfen.
   HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Vertiefung aus Polypropylen in der Mitte nicht mit dem Nährmedium in Berührung kommt. Dies führt zu einer Kreuzkontamination des Filterpapiers mit radioaktiv markierter Fettsäure anstelle von CO₂.
8. Inkubieren Sie die Zellkulturen für 3 h bei 37 °C mit 5% CO₂.
9. Um ¹⁴CO₂ aufzufangen, injizieren Sie 150 μl 1 N NaOH in die mittlere Vertiefung aus Polypropylen, um das Filterpapier zu benetzen, und 200 μl 1 M Perchlorsäure in das Kulturmedium. Injizieren Sie das NaOH und die Perchlorsäure, indem Sie eine Nadel durch den Gummistopfen schieben.
   HINWEIS: Der Gummistopfen darf nicht aus dem Kolben entfernt werden. Dies kann dazu führen, dass ¹⁴CO_{2 entweicht} . Um die Injektion zu erleichtern, halten Sie den Kolben in der aufrechten Position und kehren Sie nach Abschluss der Injektionen in die Kulturposition zurück.
10. Die Kolben werden 1 h lang bei 55 °C inkubiert.
11. Öffnen Sie die Kolben nach dem Abkühlen in der Zellkulturhaube. Entfernen Sie die Filterpapiere mit einer Pinzette aus den Mittelvertiefungen aus Polypropylen und legen Sie sie in 3-4 mL Szintillationsflüssigkeit (siehe Materialtabelle) in ein Szintillationsfläschchen.
    HINWEIS: 100 μl überschüssige Markierungslösung werden zu 3-4 ml der Szintillationsflüssigkeit gegeben, um die Gesamtzahl der Aktivität zu messen. 100 μl Basalkulturmedium (ohne [^1-14C]-Ölsäure) werden zu 3-4 ml Szintillationsflüssigkeit gegeben, um die Hintergrundaktivität zu messen.
12. Nach einer Inkubation bei Raumtemperatur für 1 h oder über Nacht ist die Radioaktivität in Zählungen pro Minute (cpm) mit einem Szintillationszähler zu messen (siehe Materialtabelle).
13. Um die cpm-Ergebnisse zu normalisieren, isolieren Sie die Proteinextrakte aus den unmarkierten T-25-Kolben für jede Kulturbedingung. Mit 5 mL phosphatgepufferter Kochsalzlösung waschen, 1 mL RIPA-Zelllysepuffer in jeden Kolben geben und die Zelloberfläche mit einem Zellschaber abkratzen.
    1. Den RIPA-Puffer mit einer Pipette in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen und bei 19.000 x g für 20 min bei 4 °C zentrifugieren. Übertragen Sie den Überstand mit einer Pipette in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen und bestimmen Sie die Proteinkonzentration gemäß dem BCA-Assay-Protokoll (siehe Materialtabelle).
    2. Dividieren Sie die rohen cpm-Messwerte vom Szintillationszähler durch die Proteinkonzentration, um das normalisierte cpm von ¹⁴CO₂ zu erhalten (Tabelle 1).
14. Befolgen Sie die örtlichen Anforderungen zur Entsorgung der Szintillationsfläschchen, Zellkulturmaterialien, des Mediums, der Spritzen usw. Dekontaminieren Sie die Arbeitsflächen und führen Sie Radioaktivitäts-Wischtests gemäß den örtlichen Anforderungen durch.

2. Sammlung von säurelöslichen Metaboliten

ANMERKUNG: Die in Schritt 1.8 verwendete Inkubationszeit von 3 Stunden reicht möglicherweise nicht aus, um die gesamte von den Zellen aufgenommene [^1-14C] Vollölsäure zu CO₂ zu oxidieren. Der Fluss im Oxidationsweg von Fettsäuren kann auch durch Messung der Radioaktivität in der säurelöslichen Fraktion bestimmt werden.

1. Sammeln Sie 1 ml des angesäuerten Mediums aus jedem behandelten T-25-Kolben und überführen Sie es in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
2. 60 μl 20 % BSA und 100 μl 16 M Perchlorsäure zugeben.
3. Vortex und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
4. Anschließend bei 20.000 x g für 30 min bei 4 °C vortexen und zentrifugieren.
5. 200 μl des Überstands werden in die Szintillationsflüssigkeit gegeben und die Aktivität gemessen (Schritt 1.12).
6. Normalisieren Sie die Reads auf die Proteinkonzentration oder DNA-Messungen (Schritt 1.13.1).

3. Messung der Glukoseoxidation oder Aminosäureoxidation

1. Ersetzen Sie ¹⁴C-markierte Ölsäure durch ¹⁴C-markierte Glukose oder ¹⁴C-markierte Aminosäuren, um die Oxidation dieser Kraftstoffmoleküle zu messen.
2. Bereiten Sie Osteoblastenkulturen gemäß den Schritten 1.1-1.2 vor.
3. Um das Experiment zu starten, nehmen Sie das Nährmedium aus dem Gewebekulturkolben und ersetzen Sie es durch 1,5 ml frisches Serum-Hungermedium.
4. Eine Markierungslösung von 0,6 μCi ¹⁴C-markierter Glukose oder ¹⁴C-markierten Aminosäuren in 1 ml Hungermedium herstellen und in Kolben geben.
5. Führen Sie die Schritte 1.6-1.13 aus.

Die enzymatische Aktivität sowohl der Carnitin-Palmitoyltransferase-1 (Cpt1) als auch der Carnitin-Palmitoyltransferase-2 (Cpt2) ist für die Oxidation der mitochondrialen langkettigen Fettsäuren erforderlich. Cpt1 ist das geschwindigkeitsbestimmende Enzym im Stoffwechselweg, aber drei Isoformen (Cpt-1a, Cpt-1b und Cpt-1c) sind in Säugetiergenomen kodiert, und die genetische Störung einer Isoform kann zu einer kompensierenden Hochregulierung einer anderen Isoform^fü...

Das oben beschriebene Verfahren ermöglicht die direkte Beurteilung der Fettsäureoxidation, da es sich bei den gemessenen Ausgängen um ¹⁴CO₂ handelt, die auf dem mit NaOH getränkten Filterpapier gesammelt wurden, und um säurelösliche Metaboliten, die nach der Ansäuerung der Kultur mit Perchlorsäure gesammelt wurden. Kommerziell erhältliche Assay-Kits, die fluoreszenzmarkierte Lipidmoleküle oder Lipidanaloga verwenden, können die Lipidaufnahme messen, aber ...

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Diese Arbeit wurde durch einen Merit Review Award des Biomedical Laboratory Research and Development Service des Veterans Affairs Office of Research and Development (BX003724) und einen Zuschuss des National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (DK099134) unterstützt.