הערכת חמצון חומצות שומן בתאי עצם מתורבתים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר בדיקה להערכת היכולת לחמצון חומצות שומן בתרביות של תאי עצם ראשוניים או קווי תאים רלוונטיים.

היווצרות עצם על ידי הבחנה בין אוסטאובלסטים צפויה לדרוש קלט אנרגטי משמעותי מכיוון שתאים מיוחדים אלה חייבים לסנתז חלבוני מטריצה חוץ-תאיים גדולים המרכיבים רקמת עצם ולאחר מכן לרכז את היונים הדרושים למינרליזציה שלה. נתונים על הדרישות המטבוליות של היווצרות עצם צצים במהירות. בעוד שעדיין יש הרבה מה ללמוד, צפוי כי שיבושים בחילוף החומרים המתווך תורמים למחלות שלד. כאן, מתואר פרוטוקול להערכת יכולתם של תאים אוסטאובלסטיים לחמצן ¹⁴חומצות שומן המסומנות C ^ל-14CO₂ ומטבוליטים מסיסים בחומצה. חומצות שומן מייצגות מאגר אנרגיה עשיר שניתן לקחת ממחזור הדם לאחר האכלה או לאחר שחרורן ממאגרי רקמת השומן. הבדיקה, המבוצעת בצלוחיות תרבית רקמה T-25, מועילה לחקר רווח או אובדן תפקוד גנים על ניצול חומצות שומן והשפעת אותות אנבוליים בצורה של גורמי גדילה או מורפוגנים הנחוצים לשמירה על מסת העצם. פרטים על היכולת להתאים את הפרוטוקול להערכת החמצון של גלוקוז או חומצות אמינו כמו גלוטמין מסופקים גם כן.

האוסטאובלסטים, שמקורם בתאי אב הנמצאים במח העצם ובפריאוסטאום, אחראי על סינתזה והפרשה של המטריצה המינרלית והעשירה בקולגן המרכיבה את רקמת העצם. כדי להגשים את המאמץ היקר מבחינה אנרגטית ולתרום לשמירה על שלמות השלד לכל החיים, תאים מיוחדים אלה שומרים על רשתית אנדופלזמית מחוספסת בשפע החיונית לסינתזה של חלבוני מטריצה חוץ-תאיים ^1,2 ומספר רב של מיטוכונדריות בעלות פוטנציאל ממברנה גבוה כדי לקצור את האנרגיה הכימית הנדרשת ממצעי דלק ^3,4. החשיבות של פונקציה אחרונה זו מודגמת על ידי הפסקת צמיחת העצם והתפתחות אוסטאופניה ^5,6 הקשורה לגירעונות אנרגיה כמו בהגבלת קלוריות. זהות מקור הדלק המועדף על האוסטאובלסטים והנתונים על הדרישות המטבוליות של האוסטאובלסטים במהלך התמיינות או בתגובה לאיתות אנאבולי^{מתגלים 7,8}.

חומצות שומן ארוכות שרשרת מייצגות אספקה עשירה של אנרגיה כימית הקיימת בסרום ומשתחררת מרקמת השומן בתגובה לצריכת קלוריות מופחתת או הוצאת אנרגיה מוגברת. לאחר חציית קרום התא וקשירה לקו-אנזים A כדי להגביר את המסיסות, acyl-CoA שומני מועברים למטריצה המיטוכונדריאלית על ידי אנזימי הקרניטין הכפולים palmitoyltransferase על הממברנות המיטוכונדריאליות החיצוניות והפנימיות וקרניטין-אצילקרניטין^{טרנסלוקאז 7}. בתוך המטריצה המיטוכונדריאלית, שרשרת מנגנון החמצון β מקצרת את acyl-CoA בתהליך בן 4 שלבים המייצר אצטיל-CoA שנכנס למחזור TCA (מחזור חומצה טריקרבוקסילית) ומפחית מקבילות. קטבוליזם של פלמיטט (C₁₆), חומצות השומן הנפוצות ביותר בבעלי חיים, דרך מסלול זה מניב ~131 ATP, באופן משמעותי יותר מ~38 ATP שנוצר על ידי חמצון גלוקוז⁷.

מחקרי מעקב באמצעות ליפידים עם תוויות רדיו הצביעו על כך שהעצם תופסת חלק משמעותי מהשומנים במחזור ^9,10, בעוד שאבלציה גנטית של אנזימים קריטיים לקטבוליזם של שומנים מובילה להפחתה בפעילות האוסטיאובלסטים ואובדן עצם ^9,11. הפרוטוקול המוצג כאן משתמש ^ב-14חומצות שומן עם תווית C כדי להעריך את יכולתם של אוסטאובלסטים מתורבתים לבצע חילוף חומרים מלא של חומצות שומן ל-CO₂ או מטבוליטים מסיסים בחומצה, המייצגים שלבי ביניים בתהליך החמצון. בעוד שהשימוש ברדיואקטיביות נדרש, השיטה פשוטה, דורשת השקעה מוגבלת וניתנת להתאמה לטובת מטבוליטים וסוגי תאים אחרים המסומנים ברדיו.

פרוטוקול זה משתמש בהמרה של [^1-14C]-חומצה אולאית ^ל-14CO₂ כאינדיקטור ליכולת חמצון חומצות שומן. המשרד המקומי לבטיחות קרינה אישר את הפרוטוקול לשימוש בחומרים רדיואקטיביים לפני תחילת הניסויים. כל הליכי הקרינה בוצעו מאחורי מגן פרספקס באמצעות ציוד מגן אישי מתאים. הוועדה המקומית לטיפול ושימוש בבעלי חיים אישרה את הפרוטוקול לפני השימוש בתאים ראשוניים.

1. חמצון חומצות שומן באוסטיאובלסטים מתורבתים

1. תת-תרבית את האוסטיאובלסטים הראשוניים של הקלוריאלים¹² או קו תאים אוסטאובלסטי כמו Mc3t3-E1, וצלחת בצלוחיות T-25 (5 x 10⁵ תאים לבקבוק) ב-α-MEM המכילים 10% סרום בקר עוברי, 100 U/mL של פניצילין ו-0.1 מיקרוגרם/מ"ל של סטרפטומיצין.
   1. זרעים 3-4 צלוחיות לכל קבוצת טיפול (כלומר, בקרה ונוקאאוט גנים או טיפול רכב ותרופתי) לשימוש בניסוי. זרע 1-2 צלוחיות נוספות לכל קבוצת טיפול כדי לנרמל למספר תאים או ריכוזי חלבון. דגרו את צלוחיות התרבות בחממת תרבית תאים לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
2. תרבית את התאים במשך 2-3 ימים עד שהצלוחיות מתלכדות. גרמו לתרביות הקונפלואנט להתמיין על ידי הוספת 50 מיקרוגרם/מ"ל של חומצה אסקורבית ו-10 מ"מ של β-גליצרול פוספט (ראה טבלת חומרים) למצע התרבות והמשיכו בתרבית עד 14 ימים נוספים.
   הערה: הרעבה בסרום (הוספת 0.5%-1% FBS) במהלך הלילה היא הכרחית אם מתוכננים טיפולים בגורמי גדילה. הורדת אחוז ה-FBS מגבילה את כמות השומנים שאינם מסומנים ברדיו בתרבית ומאפשרת את ההשפעה המקסימלית של גורמי גדילה אקסוגניים. אם יש לבדוק את השפעות ההורמונים, משתמשים ב-FBS ללא פחם.
3. הכן את נייר המסנן, פקקי שרוול גומי בגודל 15 מ"מ על 30 מ"מ ובארות מרכזיות מפוליפרופילן (ראה טבלת חומרים) יום לפני הניסוי.
   1. מקפלים רצועת נייר פילטר בגודל 1 ס"מ על 10 ס"מ בצורת מאוורר ומניחים אותה בדלי של באר מרכז הפוליפרופילן. לחץ היטב על זרוע מרכז הפוליפרופילן דרך מרכז פקק שרוול הגומי והורד היטב את מרכז הפוליפרופילן לתוך בקבוק T-25. לאחר מכן אטמו את הבקבוק עם פקק השרוול (איור 1).
      הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים היטב את מיקום מרכז הפוליפרופילן כדי להבטיח שהוא לא יבוא במגע עם מדיום התרבית. במהלך הניסוי, מרכז הפוליפרופילן מונע היטב מנייר הסינון לגעת במדיום התיוג ומאפשר איסוף של ¹⁴CO₂.
4. ביום הניסוי, הצמד [^1-14C]-חומצה אולאית לאלבומין בסרום בקר (BSA) על ידי ערבוב 20% אלבומין בסרום בקר בתמיסת מלח עם פוספט (5 מיקרוליטר לבקבוק) עם 0.1 μCi/mL של [^1-14C]-חומצה אולאית (0.6 מיקרוליטר / בקבוק) בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
   1. לאחר מכן הנח את הצינור בצינור חרוטי של 50 מ"ל ודגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם ניעור עדין. הכן 1-2 צלוחיות נוספות עבור מצומדים של חומצה אולאית-BSA כדי להסביר שגיאת פיפטינג.
5. הסר את מדיום התרבית מבקבוק תרבית הרקמה והחלף אותו ב-1.5 מ"ל של מצע רעב טרי בסרום (שלב 1.2).
6. עבור כל בקבוק, שלב 5.6 מיקרוליטר של תמיסת חומצה אולאית-BSA (שלב 1.4) עם 2 מיקרוליטר של תמיסת קרניטין של 100 מ"מ ו-1 מ"ל של מצע תרבית כדי לייצר תמיסת תיוג. הוסף את תמיסת התיוג לצלוחיות התרבות. שמור את הפתרון העודף כדי לקרוא את ספירת הפעילות הכוללת שנוספה לבדיקה.
   הערה: תמיסת התיוג אינה מתווספת לצלוחיות הנוספות שנועדו לכמת את מספר התאים או ריכוז החלבון.
7. הורד את בארות מרכז הפוליפרופילן המכילות את נייר הסינון בבקבוק ולאחר מכן כסה אותו עם פקק הגומי.
   הערה: זה קריטי שבאר מרכז הפוליפרופילן לא תיצור קשר עם מדיום התרבות. זה יוביל לזיהום צולב של נייר הסינון עם חומצת שומן עם תווית רדיו במקום CO₂.
8. דגרו על תרביות התאים למשך 3 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
9. כדי לאסוף ¹⁴CO₂, הזריק 150 מיקרוליטר של 1 N NaOH לבאר מרכז הפוליפרופילן כדי להרטיב את נייר הסינון ו-200 מיקרוליטר של חומצה פרכלורית 1 M למדיום התרבית. הזרקו את ה-NaOH והחומצה הפרכלורית על ידי דחיפת מחט דרך פקק הגומי.
   הערה: אין להסיר את פקק הגומי מהבקבוק. זה עלול לגרום ^ל-14CO₂ לברוח. כדי להקל על ההזרקה, שמור את הבקבוק במצב זקוף ולאחר מכן חזור למצב התרבות לאחר השלמת ההזרקות.
10. דגרו את הצלוחיות בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך שעה.
11. פתח את הצלוחיות לאחר קירורן במכסה המנוע של תרבית התאים. הסר את ניירות הסינון מבארות מרכז הפוליפרופילן בעזרת פינצטה והנח אותם ב-3-4 מ"ל של נוזל נצנוץ (ראה טבלת חומרים) בבקבוקון נצנוץ.
    הערה: 100 מיקרוליטר של תמיסת תיוג עודפת מתווספים ל-3-4 מ"ל של נוזל הנצנוץ כדי למדוד את ספירת הפעילות הכוללת. 100 מיקרוליטר של מצע תרבית בסיסית (ללא [^1-14C]-חומצה אולאית) מתווסף ל-3-4 מ"ל של נוזל נצנוץ כדי למדוד את פעילות הרקע.
12. לאחר דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה או לילה, מדוד את הרדיואקטיביות בספירה לדקה (cpm) באמצעות מונה נצנוץ (ראה טבלת חומרים).
13. כדי לנרמל את תוצאות ה-cpm, בודד את תמציות החלבון מצלוחיות T-25 הלא מסומנות עבור כל מצב תרבית. שוטפים עם מי מלח עם 5 מ"ל פוספט, מוסיפים 1 מ"ל מאגר ליזה של תאי RIPA לכל בקבוק, ומגרדים את פני התא בעזרת מגרד תאים.
    1. העבירו את מאגר ה-RIPA לצינור מיקרו-צנטריפוגה עם פיפטה וצנטריפוגה ב-19,000 x גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנטנט עם פיפטה לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי וקבעו את ריכוז החלבון על פי פרוטוקול בדיקת BCA (ראו טבלת חומרים).
    2. חלקו את קריאות ה-cpm הגולמיות ממונה הנצנוץ בריכוז החלבון כדי לקבל את ה-cpm המנורמל של ¹⁴CO₂ המיוצר (טבלה 1).
14. עקוב אחר הדרישות המקומיות כדי להיפטר מבקבוקוני הנצנוץ, חומרי תרבית התאים, המדיום, המזרקים וכו'. לטהר את משטחי העבודה ולבצע בדיקות ניגוב רדיואקטיביות בהתאם לדרישות המקומיות.

2. איסוף מטבוליטים מסיסים בחומצה

הערה: תקופת הדגירה של 3 שעות המשמשת בשלב 1.8 לעיל עשויה שלא להספיק כדי לחמצן את כל החומצה האולאית המלאה [^1-14C] שנקלטת על ידי התאים ל-CO₂. ניתן להעריך את השטף במסלול חמצון חומצות השומן גם על ידי מדידת רדיואקטיביות בחלק המסיס בחומצה.

1. אסוף 1 מ"ל מהחומר המחומצן מכל בקבוק T-25 מטופל והעביר אותו לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
2. הוסף 60 מיקרוליטר של 20% BSA ו-100 מיקרוליטר של חומצה פרכלורית 16 M.
3. מערבולת ודגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
4. לאחר מכן, מערבולת וצנטריפוגה ב-20,000 x גרם למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
5. הוסף 200 מיקרוליטר של הסופרנטנט לנוזל הנצנוץ ומדוד את הפעילות (שלב 1.12).
6. נרמל את הקריאות לריכוז החלבון או למדידות ה-DNA (שלב 1.13.1).

3. מדידת חמצון גלוקוז או חמצון חומצות אמינו

1. החלף ¹⁴חומצה אולאית עם תווית C ^ב-14גלוקוז עם תווית C או ¹⁴חומצות אמינו עם תווית C כדי למדוד את החמצון של מולקולות דלק אלה.
2. הכן תרביות אוסטאובלסטים לפי שלבים 1.1-1.2.
3. כדי להתחיל את הניסוי, הסר את מדיום התרבית מבקבוק תרבית הרקמה והחלף אותו ב-1.5 מ"ל של מצע רעב טרי בסרום.
4. הכינו תמיסת תיוג של 0.6 μCi של ¹⁴גלוקוז עם תווית C או ¹⁴חומצות אמינו עם תווית C ב-1 מ"ל של אמצעי רעב והוסיפו לצלוחיות
5. בצע את שלבים 1.6-1.13.

פעילות אנזימטית של קרניטין פלמיטואיל טרנספראז-1 (Cpt1) וקרניטין פלמיטואיל טרנספראז-2 (Cpt2) נדרשת לחמצון חומצות שומן ארוכות שרשרת מיטוכונדריה. Cpt1 הוא האנזים המגביל את הקצב במסלול המטבולי, אך שלושה איזופורמים (Cpt-1a, Cpt-1b ו-Cpt-1c) מקודדים בגנום של יונקים, והשיבוש הגנטי של איזופורם א?...

ההליך המתואר לעיל מאפשר הערכה ישירה של חמצון חומצות שומן שכן התפוקות הנמדדות הן ¹⁴CO₂ שנאספו על נייר הסינון הספוג NaOH ומטבוליטים מסיסים בחומצה שנאספו לאחר החמצת התרבית בחומצה פרכלורית. ערכות בדיקה זמינות מסחרית המשתמשות במולקולות ליפידים עם תווית פלואורסצנטי?...

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

עבודה זו נתמכה על ידי פרס סקירת הצטיינות משירות המחקר והפיתוח של המעבדה הביו-רפואית של המשרד למחקר ופיתוח לענייני חיילים משוחררים (BX003724) ומענק מהמכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (DK099134).