Obezite Sırasında Lenfatik ve Kan Ağı Analizi

Obezite giderek büyüyen küresel bir halk sağlığı sorunudur. Daha önce lenfatik disfonksiyon ile ilişkilendirilmiştir, bu da yağ dokusu ile lenfatik sistem arasında hayati bir karışma olduğunu düşündürmektedir. Burada, deri altı yağ dokusu içindeki kan ve lenfatik vaskülatürlerin farklı şekilde etiketlenmesine izin veren erişilebilir bir metodoloji öneriyoruz.

Lenfatik toplayıcı damarlar ve lenf düğümleri kaçınılmaz olarak yağ dokusuna gömülür. Bu gözlemin fizyolojik önemi hala açıklığa kavuşturulmamıştır. Bununla birlikte, obezite, bozulmuş lenfatik fonksiyon ve artmış damar geçirgenliği ile karakterizedir. Tersine, lenfatik disfonksiyon farelerde obeziteye neden olur ve lenfatik damarlar ile yağ dokusu arasında önemli bir etkileşim olduğunu düşündürür. Bu nedenle, lenfatik disfonksiyona yol açan faktörlerin anlaşılması, obezite ve ilişkili komorbiditeleri önlemek için yeni terapötik pencereler açabilir. Bu süreçteki ilk adım, sağlıklı ve iltihaplı yağ dokusunda lenfatik ağın kesin ve ayrıntılı bir şekilde görüntülenmesini gerektirir. Burada, lenfatik ve kan damarlarını etiketlemeye ve analiz etmeye izin veren hızlı, ucuz ve verimli bir yöntemi açıklıyoruz. Bu yaklaşım, deri altı yağ dokusu içinde cildi boşaltan brakiyal lenf nodu lokalizasyonundan yararlanır. Bu dokunun lenfatik arborizasyonu, florokrom konjuge lektinlerin deri altına enjekte edilmesiyle ortaya çıkarılabilir. Ayrıca, in vivo etiketleme yaklaşımı, lenfatik damar yoğunluğunu ve fonksiyonlarını değerlendirmek için bir yol sağlar. Kan damarı, adiposit ve bağışıklık hücresi boyaması ile birleştiğinde, protokol deri altı yağ dokusunun 3D görüntüleme ile yüksek çözünürlüklü haritalanmasına izin verir.

Lenfatik dolaşım sistemi, doku homeostazının korunmasında ve etkili bağışıklık tepkilerinin indüksiyonunda çok önemli bir rol oynar. Lenfatik damarlar kan damarlarına paralel olarak uzanır ve interstisyel sıvıyı, metabolitleri ve bağışıklık hücrelerini lokal drenaj lenf noduna (LN) ve son olarak venöz dolaşıma¹ taşır. Enfeksiyon, inflamasyon ve metabolik hastalıklar sırasında disfonksiyonel lenfatik drenaj gözlenmiştir 2,3,4,5. Lenfatik damar sistemi, lenfatik kılcal damarlar adı verilen küçük boyutlu damarlardan oluşur. Lenfatik kılcal damarlar, interstisyel sıvıyı, metabolitleri ve bağışıklık hücrelerini, özellikle dendritik hücreleri (DC'ler) ve T hücrelerini, lenfatik kılcal lümene girişi kolaylaştıran açık bağlantılar ("düğme benzeri" bağlantılar) ile karakterize edilen tek bir ince lenfatik endotel hücresi (LEC) tabakasından oluşur⁵. Lenfatik kılcal damarlar, lenfatik toplayıcı damarlar adı verilen daha büyük damarlara birleşir. Lenfatik toplayıcılar, otonom kasılma tonusu sağlayan ve sıvı akışını koruyan bir kas tabakası ile çevrili bir LEC tabakası ile karakterize edilir⁵. Ayrıca, toplama damarları tek yönlü bir lenf akışı sağlayan valflere sahiptir.

Kollektörlerin ve kılcal damarların LEC'leri, onları kan endotel hücrelerinden (BEC'ler) ayıran belirli bir dizi belirteç ifade eder. Bu faktörler arasında Prox1, LEC üretimine rehberlik eden bir transkripsiyon faktörüdür ve BEC'lerde yokken LEC'lerde yüksek oranda ifade edilir. Prox1'in LEC'lerin biyolojisindeki kritik katılımı, Prox1 eksikliği olan farelerin⁶ üretilmesi ve analizi ile gösterilmiştir. Prox1 heterozigot fareler, azalmış lenfatik damar yoğunluğu ve artmış vasküler geçirgenlik⁶ ile karakterize kusurlu bir lenfatik vasküler sistem gelişimine sahiptir. LEC'ler VEGFR3, Podoplanin ve CCL21^5'i yüksek oranda eksprese eder. Bu belirteçler BEC'lerde bulunmaz ve lenfatik ve kan damarları ağını ayrı ayrı analiz etmeye izin verir. Lyve1, toplama damarlarında^{yokken lenfatik} kılcal damarlar tarafından seçici olarak eksprese edilir 5.

Mitokondriyal içeriklerine ve sonraki renklerine göre üç tip yağ dokusu tanımlanmıştır. Mitokondri açısından zengin termojenik kahverengi yağ dokusu, soğuğa maruz kalma sırasında önemli bir rol oynar ve farelerde interskapular bölgede bulunur ^7,8. Beyaz ve bej adipositler daha düşük mitokondriyal yoğunluğa sahiptir ve esas olarak lipit damlacıkları şeklinde enerji depolamasında rol oynarlar. Beyaz ve bej adipositler viseral ve subkutan depolarda^{bulunur 9}.

Klinik gözlemler obezite ve lenfatik disfonksiyon arasında bir bağlantı kurmuştur¹⁰. Obezite, yağ dokusu lenfatik vaskülatüründe morfolojik değişikliklere neden olur ve lenf transportunun bozulmasına yol açar¹¹. Klinik öncesi modellerde elde edilen veriler, Yüksek Yağlı Diyetin (HFD) lenfatik yeniden şekillenmeye neden olduğunu ve obez farelerin daha küçük lenf düğümlerine ve daha az sayıda lenfatik damara sahip olduğunu ortaya koymuştur¹². Bununla birlikte, bu fenotipi yöneten kesin moleküler mekanizmalar açıklığa kavuşturulmayı beklemektedir. Obezite sırasında LEC'lerin tutulumu, lenfatik damar gelişimi bozulmuş genetik modellerdeki gözlemlerle daha da desteklenmektedir. Daha önce tartışıldığı gibi, Prox1 heterozigot fareler (Prox1 ^+/-) kötü işleyen bir lenfatik sistem sunar ve Prox1 yeterli hayvanlara kıyasla tesadüfen aşırı viseral yağ dokusu birikimi geliştirir⁶. İlginç bir şekilde, bu yağ dokusu fenotipi, lenfatik fonksiyonun^{restorasyonu ile kurtarılır 13}. Birlikte, bu sonuçlar lenfatik damarlar ve yağ dokusu arasında daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyan güçlü bağlantıları gün ışığına çıkarmıştır.

Obezitenin ayırt edici bir özelliği olan inflamasyon bağlamında, LEC ve BEC belirteçlerinin değişmiş ekspresyonu, bu hücrelerin klasik antikor boyaması yoluyla analizini tehlikeye atar^14,15. Özellikle LEC'leri ve BEC'leri etiketlemek için genetik modeller geliştirilmiştir ve bu sorunu hafifletmeye izin verir 16,17,18,19. Bununla birlikte, genetik raportör hatlarının kullanımı, birden fazla ıslah aşaması gerektirir ve bir projenin uzunluğunu ve maliyetini önemli ölçüde artırır. Bu nedenle, deri altı yağ dokusundaki kan ve lenfatik dolaşım sistemlerini araştırmak için florokrom konjuge lektin enjeksiyonlarının kullanılmasını öneriyoruz, bu basit ve nispeten pahalı olmayan bir yaklaşımdır. Çeşitli florokromlara konjuge lektin ticari olarak temin edilebilir ve kan damarlarını etiketlemek için intravenöz olarak veya deri altı yağ dokusuna gömülü cildi boşaltan lenfatik damarları etiketlemek için deri altına enjekte edilebilir. Bu yaklaşım, her enjeksiyon için ayrı florokrom-lektin konjugatlarının kullanılmasına dayanır ve her bir vaskülatürün farklı şekilde etiketlenmesine izin verir. Bu yöntem aynı zamanda lenfatik veya kan damar sistemi ağını etiketlemek için genetik modellerin kullanılmasıyla da uyumludur. Daha da önemlisi, deri altı yağ dokusunun ve onu perfüze eden kan ve lenfatik damar sistemlerinin genel sağlık durumunu analiz etmek için çoklu okumalar sağlar. Bu prosedür, sedef hastalığı ve enfeksiyonlar dahil olmak üzere akut ve kronik cilt hastalıkları sırasında lenfatik ve kan damar sistemi ağlarını analiz etmek için kolayca uygulanabilir.

Tüm hayvan deneyleri yerel etik kurullara uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

NOT: Prox1-cre-ERT2 (Prox1tm3(cre/ERT2)Gco/J, Jax #022075) ve Rosa26-LSL-tdTomato (B6. Cg-Gt (ROSA) 26Sortm9 (CAG-tdTomato) Hze / J, Ai9, Jax # 007914) Jackson Laboratuvarı'ndan elde edildi ve indüklenebilir lenfatik raportör fare hattı Prox1-cre-ERT2::tdTomato'yu elde etmek için çaprazlandı. Fareler, 10 nesil boyunca C57BL / 6 arka planına geri çaprazlandı. Altı haftalık Prox1-cre-ERT2::tdTomato erkek farelere 3 hafta boyunca tamoksifen diyeti uygulandı. Envigo Teklad'dan tamoksifen diyeti (diyet no. TD.130857; 500 mg / kg) kullanıldı. Deneyler 12-14 haftalık farelerde yapıldı. Bu protokol herhangi bir yaş, cinsiyet veya suştaki fareler için geçerlidir.

1. Malzeme hazırlama

1. Makasları, forsepsleri ve diseksiyon pimlerini %70 etanol kullanarak sterilize edin.
2. 25 ila 27 gauge iğneli iki adet 1 mL şırınga hazırlayın. Deri altı enjeksiyon için, üst ayak pedine 10 μL enjekte etmek için bir mikro şırınga kullanmanızı öneririz.
3. 1,5 mL'lik plastik bir tüpte, 100 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyonda steril PBS içinde seyreltilmiş 200 μL DyLight 488-konjuge lektin hazırlayın.
4. Başka bir plastikte, 1.5 mL'lik tüp, 100 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyonda steril PBS içinde seyreltilmiş 100 μL DyLight 649 konjuge lektin hazırlar.
5. PBS içeren 6 oyuklu bir plaka hazırlayın ve buz üzerinde tutun.
6. % 4 paraformaldehit ve% 30 sükroz çözeltisi hazırlayın.

2. Deri altı yağ dokusu, kan ve lenfatik damarların etiketlenmesi.

1. % 5 izofluran soluyarak fareyi uyuşturun. İşlem sırasında hayvanın zarar görmemesini sağlamak için hayvanın pençesini sıkıca sıkıştırarak anestezi derinliğini değerlendirin. Anestezi, lektin enjeksiyon adımlarının sonuna kadar veya ötenaziye kadar sürdürülmelidir.
2. Kan damarını etiketlemek için kuyruk damarına intravenöz olarak 100 μL DyLight 488 konjuge lektin enjekte edin. Doku toplamaya devam etmeden önce 15 dakika bekleyin.
3. Farklı bir şırınga kullanarak, boşalan lenfatik damarları etiketlemek için hayvanın üst ayak pedine deri altına 10 μL DyLight 649 konjuge lektin enjekte edin. Doku toplamaya devam etmeden önce 15 dakika bekleyin.
4. Enjeksiyondan 15 dakika sonra servikal çıkık veya CO_2'ye maruz bırakarak fareyi ötenazi yapın.

3. Deri altı yağ dokusunun toplanması

1. Fareyi bir diseksiyon tahtasının üzerine sırt üstü yatırın.
2. Farenin kürkünü% 70 etanol kullanarak sterilize edin.
3. Forseps kullanarak kanadın derisini kaldırın ve brakiyal yağ pedini ortaya çıkarmak için enine bir kesi yapın.
4. Brakiyal yağ dokusu deposundan ayırmak için cildi nazikçe çekin, böylece lenf nodu ve lenfatik toplayıcı damarı içeren tüm deri altı brakiyal yağ dokusunu ortaya çıkarın.
5. Forseps ve makas kullanarak, deri altı yağ depolarını nazikçe çıkarın ve bunları soğuk PBS içeren bir tabağa aktarın. En iyi sonuçlar için, yağ depolarını tek parça olarak çıkarmanızı öneririz.
6. Buradan itibaren dokuyu ışıktan koruyun.

4. Doku fiksasyonu

1. Hasat edilen dokuyu %4 paraformaldehit ve %30 sükroz içeren bir çözeltiye batırın.
2. Dokuyu görüntüleme için hazırlamadan önce en az gece boyunca bu solüsyonda inkübe edin.

5. Boyama ve görüntüleme

1. En iyi sonuçlar için, Gilleron ve meslektaşları²⁰ tarafından tarif edildiği gibi doku temizleme ve 3D konfokal edinim gerçekleştirin. Büyük dokuların analizi için bir ışık tabakası mikroskobu kullanmanızı öneririz. Temizleme işlemi sırasında ek boyama yapılabilir.
2. En iyi doku haritalamasını elde etmek için aşağıdaki antikorların kullanılması:
   Adipositler için: Perilipin
   Makrofajlar için: CD68 ve CD11b boyama.
   Dendritik hücreler için: MHC II ve CD11b.
   B hücreleri için: B220 (CD45R) boyama.
   T hücreleri için: CD3 boyama.
   NOT: Bu yöntem, bağışıklık hücrelerini etiketlemek için genetik modellerin kullanımıyla uyumludur.
3. Lenfatik kollektör damarının intravital 2-foton mikroskobu ile analizi için, lektini alt ayak pedine deri altına enjekte edin ve popliteal lenfatik toplama damarını görselleştirin.

Brakiyal yağ dokusu kanı ve lenfatik damar ağlarının topolojik analizini yapmak için subkutan olarak Alexa Fluor 649-konjuge lektin ve intravenöz olarak enjekte edilen Alexa Fluor 488-konjuge lektin enjekte edildi. Brakiyal yağ dokusu dikkatli bir şekilde eksize edildi, fikse edildi, temizleme protokolüne tabi tutuldu ve tam mount boyama ile analiz edildi. Prosedürün şematik bir gösterimi Şekil 1A'da yer almaktadır. Kan damarları yeşil renk...

Bu yaklaşım, deri altı yağ dokusunun kan ve lenfatik vaskülatürlerinin verimli ve sağlam bir şekilde etiketlenmesini sağlar. Kan ve lenfatik endotel ağlarının ayrı ayrı analizi, obezite veya diğer patolojik durumlar sırasında dolaşım sistemlerinden birini veya her ikisini etkileyen patolojik mekanizmaları çözebilir. Bu protokol, vasküler sistemlerin mimarisini, stromal ve immün hücrelerle etkileşimlerini ve sağlık ve hastalık sırasındaki işlevselliklerini ...

Yazarların beyan edecek herhangi bir açıklama ve çıkar çatışması yoktur.

SI, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM) ve Agence Nationale de la Recherche (ANR-17-CE14-0017-01 ve ANR-19-ECVD-0005-01) tarafından desteklenmektedir. AG, Ulusal Araştırma Ajansı (ANR) tarafından ANR-15-IDEX-01 referans numarasıyla yönetilen UCAJedi Geleceğe Yatırım projeleri aracılığıyla Fransız hükümeti tarafından desteklenmektedir. RSC, Lawrence C. Pakula, MD IBD Eğitim ve İnovasyon Fonu'ndan FA-2020-01-IBD-1 tarafından desteklenmektedir.