Análise linfática e de rede sanguínea durante a obesidade

A obesidade é um problema crescente de saúde pública global. Foi previamente associado à disfunção linfática, sugerindo uma interferência vital entre o tecido adiposo e o sistema linfático. Aqui, propomos uma metodologia acessível que permite a marcação distinta das vasculaturas sanguíneas e linfáticas dentro do tecido adiposo subcutâneo.

Os vasos coletores linfáticos e os gânglios linfáticos estão inevitavelmente embutidos no tecido adiposo. O significado fisiológico dessa observação ainda não foi elucidado. No entanto, a obesidade é caracterizada por função linfática prejudicada e aumento da permeabilidade dos vasos. Inversamente, a disfunção linfática induz obesidade em camundongos, sugerindo uma interação significativa entre os vasos linfáticos e o tecido adiposo. Portanto, a compreensão dos fatores que levam à disfunção linfática pode abrir novas janelas terapêuticas para prevenir a obesidade e as comorbidades associadas. O primeiro passo neste processo requer uma visualização precisa e detalhada da rede linfática no tecido adiposo saudável e inflamado. Aqui, descrevemos um método rápido, barato e eficiente que permite rotular e analisar vasos linfáticos e sanguíneos. Essa abordagem aproveita a localização do linfonodo braquial de drenagem da pele dentro do tecido adiposo subcutâneo. A arborização linfática desse tecido pode ser revelada pela injeção de lectinas conjugadas com fluorocromo por via subcutânea. Além disso, a abordagem de marcação in vivo fornece uma maneira de avaliar a densidade e as funções dos vasos linfáticos. Acoplado à coloração de vasos sanguíneos, adipócitos e células imunes, o protocolo permite o mapeamento de alta resolução do tecido adiposo subcutâneo por imagens 3D.

O sistema circulatório linfático desempenha um papel crucial na manutenção da homeostase tecidual e na indução de respostas imunes eficientes. Os vasos linfáticos correm paralelos aos vasos sanguíneos e transportam fluido intersticial, metabólitos e células imunes para o linfonodo de drenagem local (LN) e, finalmente, para a circulação venosa¹. A drenagem linfática disfuncional tem sido observada durante a infecção, inflamação e doenças metabólicas 2,3,4,5. A vasculatura linfática é composta por vasos de pequeno porte chamados capilares linfáticos. Os capilares linfáticos são formados por uma única camada de finas células endoteliais linfáticas (LECs) caracterizadas por junções abertas (junções "em forma de botão") facilitando a entrada de líquido intersticial, metabólitos e células imunes, principalmente células dendríticas (DCs) e células T, no lúmen capilar linfático⁵. Os capilares linfáticos se fundem em vasos maiores chamados vasos coletores linfáticos. Os coletores linfáticos são caracterizados por uma camada de LECs circundada por uma camada muscular que fornece tônus contrátil autônomo e mantém o fluxo de fluidos⁵. Além disso, os vasos coletores possuem válvulas que garantem um fluxo linfático unidirecional.

As LECs de coletores e capilares expressam um conjunto específico de marcadores que as distinguem das células endoteliais do sangue (BECs). Dentre esses fatores, Prox1 é um fator de transcrição que orienta a geração de LECs e é altamente expresso em LECs enquanto ausente em BECs. O envolvimento crítico de Prox1 na biologia dos LECs foi ilustrado pela geração e análise de camundongos deficientes em Prox1⁶. Camundongos heterozigotos Prox1 têm um desenvolvimento defeituoso da vasculatura linfática caracterizado por densidade de vasos linfáticos reduzida e aumento da permeabilidade vascular⁶. Os LECs expressam VEGFR3, Podoplanina e CCL21⁵. Esses marcadores não são encontrados nas CEBs e permitem analisar separadamente a rede de vasos linfáticos e sanguíneos. Lyve1 é seletivamente expresso por capilares linfáticos enquanto ausente nos vasos coletores⁵.

Três tipos de tecido adiposo foram descritos com base em seu conteúdo mitocondrial e cor subsequente. O tecido adiposo marrom termogênico rico em mitocôndrias desempenha um papel fundamental durante a exposição ao frio e está localizado na região interescapular em camundongos ^7,8. Os adipócitos brancos e bege têm menor densidade mitocondrial e estão envolvidos principalmente no armazenamento de energia na forma de gotículas lipídicas. Os adipócitos brancos e bege estão localizados em depósitos viscerais e subcutâneos⁹.

Observações clínicas estabeleceram uma ligação entre obesidade e disfunção linfática¹⁰. A obesidade induz alterações morfológicas da vasculatura linfática do tecido adiposo e leva a um transporte linfático prejudicado¹¹. Dados obtidos em modelos pré-clínicos revelaram que a dieta hiperlipídica (HFD) induz uma remodelação linfática e camundongos obesos têm linfonodos menores e menor número de vasos linfáticos¹². No entanto, os mecanismos moleculares precisos que governam esse fenótipo ainda precisam ser elucidados. O envolvimento dos LECs durante a obesidade é ainda apoiado por observações em modelos genéticos com desenvolvimento de vasos linfáticos prejudicados. Como discutido anteriormente, camundongos heterozigotos Prox1 (Prox1+^/-) apresentam um sistema linfático com mau funcionamento e, coincidentemente, desenvolvem acúmulo excessivo de tecido adiposo visceral em comparação com animais suficientes para Prox1⁶. Curiosamente, esse fenótipo de tecido adiposo é resgatado pela restauração da função linfática¹³. Juntos, esses resultados trouxeram à tona fortes interconexões entre os vasos linfáticos e o tecido adiposo, que precisam de mais investigação.

No contexto da inflamação, uma marca registrada da obesidade, a expressão alterada dos marcadores LEC e BEC compromete a análise dessas células por meio da coloração clássica de anticorpos^14,15. Modelos genéticos para rotular especificamente LECs e BECs foram desenvolvidos e permitem paliar esse problema 16,17,18,19. No entanto, o uso de linhagens de repórteres genéticos requer várias etapas de melhoramento e aumenta consideravelmente a duração e o custo de um projeto. Assim, propomos o uso de injeções de lectina conjugadas com fluorocromo para investigar os sistemas circulatório sanguíneo e linfático no tecido adiposo subcutâneo, uma abordagem simples e relativamente não dispendiosa. A lectina conjugada a vários fluorocromos está disponível comercialmente e pode ser injetada por via intravenosa para marcar os vasos sanguíneos ou por via subcutânea para marcar os vasos linfáticos que drenam a pele incorporados no tecido adiposo subcutâneo. Essa abordagem depende do uso de conjugados fluorocromo-lectina separados para cada injeção e permite a marcação distinta de cada vasculatura. Este método também é compatível com o uso de modelos genéticos para marcar a rede linfática ou de vasculatura sanguínea. É importante ressaltar que ele fornece várias leituras para analisar o estado geral de saúde do tecido adiposo subcutâneo e as vasculaturas sanguíneas e linfáticas que o perfundem. Este procedimento pode ser facilmente aplicado para analisar as redes linfáticas e de vasculatura sanguínea durante doenças cutâneas agudas e crônicas, incluindo psoríase e infecções.

Todas as experimentações com animais foram realizadas de acordo com os comitês de ética locais.

NOTA: Prox1-cre-ERT2 (Prox1tm3(cre/ERT2)Gco/J, Jax #022075) e Rosa26-LSL-tdTomato (B6. Cg-Gt (ROSA) 26Sortm9 (CAG-tdTomato) Hze / J, Ai9, Jax # 007914) foram obtidos do The Jackson Laboratory e cruzados para obter a linha de camundongo repórter linfático induzível Prox1-cre-ERT2 :: tdTomato. Os camundongos foram retrocruzados para o fundo C57BL / 6 por 10 gerações. Camundongos machos Prox1-cre-ERT2::tdTomato de seis semanas receberam dieta com tamoxifeno por 3 semanas. Dieta de tamoxifeno de Envigo Teklad (dieta no. TD.130857; 500 mg/kg). Os experimentos foram realizados em camundongos de 12 a 14 semanas de idade. Este protocolo é aplicável a camundongos de qualquer idade, sexo ou cepa.

1. Preparação do material

1. Esterilize tesouras, pinças e pinos de dissecação usando etanol 70%.
2. Prepare duas seringas de 1 mL com agulhas de calibre 25 a 27. Para injeção subcutânea, recomendamos o uso de uma microseringa para injetar 10 μL na pata superior.
3. Em um tubo de plástico de 1,5 mL, prepare 200 μL de lectina conjugada com DyLight 488 diluída em PBS estéril a uma concentração final de 100 μg / mL.
4. Em outro plástico, o tubo de 1,5 mL prepara 100 μL de lectina conjugada com DyLight 649 diluída em PBS estéril a uma concentração final de 100 μg/mL.
5. Prepare uma placa de 6 poços contendo PBS e mantenha-a no gelo.
6. Prepare uma solução de paraformaldeído a 4% e sacarose a 30%.

2. Marcação de vasos sanguíneos e linfáticos do tecido adiposo subcutâneo.

1. Anestesiar o camundongo por inalação de isoflurano a 5%. Avalie a profundidade da anestesia beliscando firmemente a pata do animal para garantir que o animal não seja prejudicado durante o procedimento. A anestesia deve ser mantida até o final das etapas de injeção de lectina ou até a eutanásia.
2. Injete 100 μL de lectina conjugada com DyLight 488 por via intravenosa na veia da cauda para marcar a vasculatura sanguínea. Aguarde 15 minutos antes de prosseguir com a coleta de tecidos.
3. Usando uma seringa diferente, injete 10 μL de lectina conjugada com DyLight 649 por via subcutânea na parte superior da pata do animal para rotular os vasos linfáticos de drenagem. Aguarde 15 minutos antes de prosseguir com a coleta de tecidos.
4. Eutanasiar o camundongo por luxação cervical ou exposição ao CO₂ 15 minutos após a injeção.

3. Colheita de tecido adiposo subcutâneo

1. Coloque o mouse de costas em uma placa de dissecação.
2. Esterilize o pelo do camundongo usando etanol a 70%.
3. Levante a pele do flanco com uma pinça e faça uma incisão transversal para expor a gordura braquial.
4. Puxe suavemente a pele para dissociá-la do depósito de tecido adiposo braquial, revelando assim todo o tecido adiposo braquial subcutâneo contendo o linfonodo e o vaso coletor linfático.
5. Usando fórceps e tesouras, remova suavemente os depósitos de gordura subcutânea e transfira-os para um prato contendo PBS frio. Para obter melhores resultados, recomendamos remover os depósitos de gordura como uma única peça.
6. Daqui em diante, proteja o tecido da luz.

4. Fixação tecidual

1. Mergulhe o tecido colhido em uma solução contendo 4% de paraformaldeído e 30% de sacarose.
2. Incube o tecido nesta solução pelo menos durante a noite antes de prepará-lo para a imagem.

5. Coloração e imagem

1. Para obter os melhores resultados, realize a limpeza do tecido e a aquisição confocal 3D, conforme descrito por Gilleron e colegas²⁰. Recomendamos o uso de um microscópio de folha de luz para análise de tecidos grandes. Coloração adicional pode ser realizada durante o processo de limpeza.
2. Para obter o melhor mapeamento de tecidos, use os seguintes anticorpos:
   Para adipócitos: Perilipina
   Para macrófagos: coloração CD68 e CD11b.
   Para células dendríticas: MHC II e CD11b.
   Para células B: coloração B220 (CD45R).
   Para células T: coloração CD3.
   NOTA: Este método é compatível com o uso de modelos genéticos para rotular células imunes.
3. Para a análise do vaso coletor linfático por microscopia intravital de 2 fótons, injetar a lectina por via subcutânea na pata inferior e visualizar o vaso coletor linfático poplíteo.

Para realizar a análise topológica das redes de vasos sanguíneos e linfáticos do tecido adiposo braquial, injetamos por via subcutânea a lectina conjugada com Alexa Fluor 649 e a lectina conjugada com Alexa Fluor 488 por via intravenosa. O tecido adiposo braquial foi cuidadosamente excisado, fixado, submetido ao protocolo de clareamento e analisado por coloração de montagem total. Uma representação esquemática do procedimento está incluída na Figura 1A

Essa abordagem fornece rotulagem eficiente e robusta das vasculaturas sanguíneas e linfáticas do tecido adiposo subcutâneo. A análise separada das redes endoteliais sanguíneas e linfáticas pode desvendar mecanismos patológicos que afetam um ou ambos os sistemas circulatórios durante a obesidade ou outras condições patológicas. Este protocolo tem como objetivo analisar a arquitetura dos sistemas vasculares, sua interação com células estromais e imunes, e sua funcionalidade d...

Os autores não têm divulgação e conflito de interesses a declarar.

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