تحليل الشبكة اللمفاوية والدم أثناء السمنة

السمنة هي قضية عالمية متنامية للصحة العامة. لقد ارتبط سابقا بالخلل اللمفاوي ، مما يشير إلى تداخل حيوي بين الأنسجة الدهنية والجهاز اللمفاوي. هنا ، نقترح منهجية يمكن الوصول إليها تسمح بوضع العلامات المميزة على الأوعية الدموية واللمفاوية داخل الأنسجة الدهنية تحت الجلد.

يتم تضمين أوعية التجميع اللمفاوية والغدد الليمفاوية حتما في الأنسجة الدهنية. لا تزال الأهمية الفسيولوجية لهذه الملاحظة غير موضحة. ومع ذلك ، تتميز السمنة بضعف الوظيفة اللمفاوية وزيادة نفاذية الأوعية الدموية. على العكس من ذلك ، يؤدي الخلل اللمفاوي إلى السمنة في الفئران ، مما يشير إلى تفاعل كبير بين الأوعية اللمفاوية والأنسجة الدهنية. لذلك ، فإن فهم العوامل التي تؤدي إلى الخلل الوظيفي اللمفاوي قد يفتح نوافذ علاجية جديدة للوقاية من السمنة والأمراض المصاحبة المرتبطة بها. تتطلب الخطوة الأولى في هذه العملية تصورا دقيقا ومفصلا للشبكة اللمفاوية في الأنسجة الدهنية السليمة والملتهبة. هنا ، نصف طريقة سريعة وغير مكلفة وفعالة تسمح بتسمية وتحليل الأوعية اللمفاوية والدموية. يستفيد هذا النهج من توطين العقدة الليمفاوية العضدية التي تستنزف الجلد داخل الأنسجة الدهنية تحت الجلد. يمكن الكشف عن الشجرة اللمفاوية لهذا النسيج عن طريق حقن الليكتين المترافق بالفلوروكروم تحت الجلد. علاوة على ذلك ، يوفر نهج وضع العلامات في الجسم الحي طريقة لتقييم كثافة الأوعية اللمفاوية ووظائفها. إلى جانب الأوعية الدموية والخلايا الشحمية وتلوين الخلايا المناعية ، يسمح البروتوكول برسم خرائط عالية الدقة للأنسجة الدهنية تحت الجلد عن طريق التصوير ثلاثي الأبعاد.

يلعب الجهاز الدوري اللمفاوي دورا مهما في الحفاظ على توازن الأنسجة وتحريض الاستجابات المناعية الفعالة. تعمل الأوعية اللمفاوية بالتوازي مع الأوعية الدموية وتحمل السائل الخلالي والمستقلبات والخلايا المناعية إلى العقدة الليمفاوية الموضعية (LN) وأخيرا نحو الدورة الدموية^{الوريدية 1}. لوحظ خلل في التصريف اللمفاوي أثناء العدوى والالتهابات وأمراض التمثيل الغذائي^2،3،4،5. يتكون الأوعية الدموية اللمفاوية من أوعية صغيرة الحجم تسمى الشعيرات الدموية اللمفاوية. تتكون الشعيرات الدموية اللمفاوية من طبقة واحدة من الخلايا البطانية اللمفاوية الرقيقة (LECs) التي تتميز بتقاطعات مفتوحة (تقاطعات "تشبه الزر") تسهل السائل الخلالي والمستقلبات والخلايا المناعية ، وخاصة الخلايا المتغصنة (DCs) والخلايا التائية ، والدخول إلى تجويف الشعيرات الدموية^{اللمفاوية 5}. تندمج الشعيرات الدموية اللمفاوية في أوعية أكبر تسمى أوعية التجميع اللمفاوية. تتميز المجمعات اللمفاوية بطبقة من LECs محاطة بطبقة عضلية توفر نغمة انقباضية مستقلة وتحافظ على تدفق السوائل⁵. علاوة على ذلك ، تمتلك أوعية التجميع صمامات تضمن تدفقا ليمفاويا أحادي الاتجاه.

تعبر LECs للمجمعات والشعيرات الدموية عن مجموعة محددة من العلامات التي تميزها عن الخلايا البطانية الدموية (BECs). من بين هذه العوامل ، يعد Prox1 عامل نسخ يوجه إنشاء LECs ويتم التعبير عنه بشكل كبير في LECs أثناء غيابه في BECs. تم توضيح المشاركة الحاسمة ل Prox1 في بيولوجيا LECs من خلال توليد وتحليل الفئران التي تعاني من نقص Prox1⁶. تعاني الفئران غير المتجانسة الزيجوت Prox1 من تطور الأوعية الدموية اللمفاوية المعيب الذي يتميز بانخفاض كثافة الأوعية اللمفاوية وزيادة نفاذية الأوعية الدموية⁶. تعبر LECs بشكل كبير عن VEGFR3 و Podoplanin و CCL21⁵. لا توجد هذه العلامات في BECs وتسمح بتحليل شبكة الأوعية اللمفاوية والدموية بشكل منفصل. يتم التعبير عن Lyve1 بشكل انتقائي بواسطة الشعيرات الدموية اللمفاوية بينما يكون غائبا في أوعية التجميع⁵.

تم وصف ثلاثة أنواع من الأنسجة الدهنية بناء على محتواها من الميتوكوندريا واللون اللاحق. تلعب الأنسجة الدهنية البنية الغنية بالحرارة بالميتوكوندريا دورا رئيسيا أثناء التعرض للبرد وتقع في المنطقة بين الكتفين في الفئران^7،8. تتميز الخلايا الشحمية البيضاء والبيج بكثافة أقل للميتوكوندريا وتشارك بشكل أساسي في تخزين الطاقة على شكل قطرات دهونية. توجد الخلايا الشحمية البيضاء والبيج في مستودعات حشوية وتحت الجلد⁹.

أثبتت الملاحظات السريرية وجود صلة بين السمنة والخلل اللمفاوي¹⁰. تؤدي السمنة إلى تغيرات مورفولوجية في الأوعية الدموية اللمفاوية للأنسجة الدهنية وتؤدي إلى ضعف النقل الليمفاوي¹¹. كشفت البيانات التي تم الحصول عليها في النماذج قبل السريرية أن النظام الغذائي عالي الدهون (HFD) يحفز إعادة تشكيل اللمفاوية وأن الفئران البدينة لديها غدد ليمفاوية أصغر وعدد أقل من الأوعية اللمفاوية¹². ومع ذلك ، لا يزال يتعين توضيح الآليات الجزيئية الدقيقة التي تحكم هذا النمط الظاهري. يتم دعم مشاركة LECs أثناء السمنة بشكل أكبر من خلال الملاحظات في النماذج الجينية مع ضعف نمو الأوعية اللمفاوية. كما تمت مناقشته سابقا ، فإن الفئران غير متجانسة الزيجوت Prox1 (Prox1 ^+/-) تمثل نظاما ليمفاويا سيئا ، وتطور بالصدفة تراكما مفرطا للأنسجة الدهنية الحشوية مقارنة بحيوانات Prox1 الكافية⁶. ومن المثير للاهتمام ، أن هذا النمط الظاهري للأنسجة الدهنية يتم إنقاذه عن طريق استعادة الوظيفة اللمفاوية¹³. وقد سلطت هذه النتائج معا الضوء على روابط قوية بين الأوعية اللمفاوية والأنسجة الدهنية، والتي تحتاج إلى مزيد من التحقيق.

في سياق الالتهاب ، السمة المميزة للسمنة ، فإن التعبير المتغير لعلامات LEC و BEC يضر بتحليل هذه الخلايا عن طريق تلطيخ الأجسام المضادة^{الكلاسيكية 14،15}. تم تطوير نماذج وراثية لتسمية LECs و BECs على وجه التحديد وتسمح بتخفيف هذه المشكلة^{16،17،18،19}. ومع ذلك ، فإن استخدام خطوط المراسل الجيني يتطلب خطوات متعددة للتكاثر ويزيد بشكل كبير من طول وتكلفة المشروع. وبالتالي ، نقترح استخدام حقن الليكتين المترافق بالفلوروكروم لفحص الدم والدورة الدموية اللمفاوية في الأنسجة الدهنية تحت الجلد ، وهو نهج بسيط وغير مكلف نسبيا. الليكتين المترافق مع الفلوروكرومات المختلفة متاح تجاريا ويمكن حقنه عن طريق الوريد لتسمية الأوعية الدموية ، أو تحت الجلد لتسمية الأوعية اللمفاوية التي تستنزف الجلد المضمنة في الأنسجة الدهنية تحت الجلد. يعتمد هذا النهج على استخدام اقترانات فلوروكروم ليكتين منفصلة لكل حقنة ويسمح بوضع العلامات المميزة لكل وعوية. تتوافق هذه الطريقة أيضا مع استخدام النماذج الجينية لتسمية شبكة الأوعية الدموية اللمفاوية أو الدموية. الأهم من ذلك ، أنه يوفر قراءات متعددة لتحليل الحالة الصحية العامة للأنسجة الدهنية تحت الجلد والأوعية الدموية واللمفاوية التي تتغذى عليها. يمكن تطبيق هذا الإجراء بسهولة لتحليل شبكات الأوعية الدموية اللمفاوية والدموية أثناء الأمراض الجلدية الحادة والمزمنة بما في ذلك الصدفية والالتهابات.

تم إجراء جميع التجارب على وفقا للجان الأخلاقية المحلية.

ملاحظة: Prox1-cre-ERT2 (Prox1tm3 (cre / ERT2) Gco / J ، Jax # 022075) و Rosa26-LSL-tdTomato (B6. تم الحصول على Cg-Gt (ROSA) 26Sortm9 (CAG-tdTomato) Hze / J ، Ai9 ، Jax # 007914) من مختبر جاكسون وعبرت للحصول على خط فأر المراسل اللمفاوي المحفز Prox1-cre-ERT2 :: tdTomato. تم إعادة الفئران إلى خلفية C57BL / 6 لمدة 10 أجيال. تلقت فئران ذكور الطماطم البالغة من العمر ستة أسابيع حمية تاموكسيفين لمدة 3 أسابيع. حمية تاموكسيفين من Envigo Teklad (رقم النظام الغذائي. TD.130857; 500 ملغم/كغم) استعمل. أجريت التجارب على الفئران التي تتراوح أعمارها بين 12 و 14 أسبوعا. ينطبق هذا البروتوكول على الفئران من أي عمر أو جنس أو سلالة.

1. تحضير المواد

1. عقم المقص والملقط ودبابيس التشريح باستخدام 70٪ من الإيثانول.
2. قم بإعداد حقنتين سعة 1 مل بإبر قياس 25 إلى 27. بالنسبة للحقن تحت الجلد ، نوصي باستخدام حقنة دقيقة لحقن 10 ميكرولتر في وسادة القدم العلوية.
3. في أنبوب بلاستيكي سعة 1.5 مل ، قم بإعداد 200 ميكرولتر من الليكتين المترافق DyLight 488 المخفف في PBS معقم بتركيز نهائي قدره 100 ميكروغرام / مل.
4. في بلاستيك آخر ، يقوم أنبوب سعة 1.5 مل بإعداد 100 ميكرولتر من الليكتين المترافق DyLight 649 المخفف في PBS معقم بتركيز نهائي يبلغ 100 ميكروغرام / مل.
5. قم بإعداد طبق من 6 آبار يحتوي على PBS واحتفظ به على الجليد.
6. تحضير محلول 4٪ بارافورمالدهيد و 30٪ سكروز.

2. وضع العلامات على الأنسجة الدهنية تحت الجلد والدم والأوعية اللمفاوية.

1. تخدير الفأر عن طريق استنشاق 5٪ إيزوفلوران. قم بتقييم عمق التخدير عن طريق الضغط بإحكام على مخلب للتأكد من عدم تعرض للأذى أثناء العملية. يجب الحفاظ على التخدير حتى نهاية خطوات حقن الليكتين أو حتى القتل الرحيم.
2. حقن 100 ميكرولتر من الليكتين المترافق DyLight 488 عن طريق الوريد في وريد الذيل لتسمية الأوعية الدموية. انتظر 15 دقيقة قبل الشروع في حصاد الأنسجة.
3. باستخدام حقنة مختلفة ، قم بحقن 10 ميكرولتر من الليكتين المترافق مع DyLight 649 تحت الجلد على وسادة القدم العلوية للحيوان لتسمية الأوعية اللمفاوية المستنزفة. انتظر 15 دقيقة قبل الشروع في حصاد الأنسجة.
4. القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم أو التعرض لثاني أكسيد الكربون₂ بعد 15 دقيقة من الحقن.

3. حصاد الأنسجة الدهنية تحت الجلد

1. ضع الماوس على ظهره على لوحة التشريح.
2. تعقيم فرو الفأر باستخدام 70٪ من الإيثانول.
3. ارفع جلد الخاصرة باستخدام الملقط وقم بعمل شق عرضي لكشف وسادة الدهون العضدية.
4. اسحب الجلد برفق لفصله عن مستودع الأنسجة الدهنية العضدية ، وبالتالي الكشف عن الأنسجة الدهنية العضدية تحت الجلد بالكامل التي تحتوي على العقدة الليمفاوية ووعاء المجمع اللمفاوي.
5. باستخدام الملقط والمقص ، قم بإزالة مستودعات الدهون تحت الجلد برفق وانقلها إلى طبق يحتوي على PBS بارد. للحصول على أفضل النتائج ، نوصي بإزالة مستودعات الدهون كقطعة واحدة.
6. من الآن فصاعدا ، قم بحماية الأنسجة من الضوء.

4. تثبيت الأنسجة

1. اغمر الأنسجة المحصودة في محلول يحتوي على 4٪ بارافورمالدهيد و 30٪ سكروز.
2. احتضان الأنسجة في هذا المحلول طوال الليل على الأقل قبل تحضيرها للتصوير.

5. تلطيخ وتصوير

1. للحصول على أفضل النتائج ، قم بإجراء إزالة الأنسجة والاكتساب متحد البؤر ثلاثي الأبعاد كما هو موضح من قبل جيلرون^{وزملاؤه 20}. نوصي باستخدام مجهر الألواح الضوئية لتحليل الأنسجة الكبيرة. يمكن إجراء تلطيخ إضافي أثناء عملية المقاصة.
2. لتحقيق أفضل رسم خرائط للأنسجة ، استخدم الأجسام المضادة التالية:
   للخلايا الشحمية: بيريبين
   للضامة: تلطيخ CD68 و CD11b.
   للخلايا المتغصنة: معقد التوافق النسيجي الكبير II و CD11b.
   للخلايا البائية: تلطيخ B220 (CD45R).
   للخلايا التائية: تلطيخ CD3.
   ملاحظة: هذه الطريقة متوافقة مع استخدام النماذج الجينية لتسمية الخلايا المناعية.
3. لتحليل وعاء المجمع اللمفاوي عن طريق الفحص المجهري داخل الحيوية 2-فوتون ، قم بحقن الليكتين تحت الجلد في وسادة القدم السفلية وتصور وعاء التجميع اللمفاوي المأبضي.

لإجراء تحليل طوبولوجي لدم الأنسجة الدهنية العضدية وشبكات الأوعية اللمفاوية ، قمنا بحقن الليكتين المترافق Alexa Fluor 649 تحت الجلد ، وحقنا الليكتين المترافق Alexa Fluor 488 عن طريق الوريد. تم استئصال الأنسجة الدهنية العضدية بعناية ، وإصلاحها ، وتقديمها إلى بروتوكول المقاصة ، وتحلي?...

يوفر هذا النهج وضع علامات فعالة وقوية للدم والأوعية اللمفاوية للأنسجة الدهنية تحت الجلد. قد يكشف التحليل المنفصل للشبكات البطانية الدموية واللمفاوية عن الآليات المرضية التي تؤثر على أحد أو كليهما في الدورة الدموية أثناء السمنة أو الحالات المرضية الأخرى. يهدف هذا البرو...

ليس لدى أصحاب البلاغ أي إفصاح أو تضارب في المصالح للإعلان عنهم.

يتم دعم SI من قبل المعهد الوطني للبحوث الطبية (INSERM) والوكالة الوطنية للبحوث (ANR-17-CE14-0017-01 و ANR-19-ECVD-0005-01). يتم دعم AG من قبل الحكومة الفرنسية ، من خلال UCAJedi Investments in the Future المشاريع التي تديرها الوكالة الوطنية للبحوث (ANR) بالرقم المرجعي ANR-15-IDEX-01. يتم دعم RSC من قبل FA-2020-01-IBD-1 من صندوق لورانس سي باكولا ، MD IBD للتعليم والابتكار ".