Мы изучаем взаимодействие между рецепторными тирозинкиназами и плазматической мембраной млекопитающих. Мы хотим знать, как липидные рафты и липидная асимметрия управляют локализацией, активацией и передачей сигналов рецепторов. Изучать липидные плоты напрямую сложно, потому что они маленькие, динамичные и чувствительные к температурным условиям.
Исследователям часто приходится использовать модельные системы с большими областями порядка для изучения взаимодействий. Синтетические везикулы и везикулы плазматических мембран представляют собой несовершенные представления клеточных мембран, лишенных липидной асимметрии и органелл. Работая с живыми клетками, мы добиваемся точного представления плазматической мембраны.
Они подчеркивают инициацию рецепторной сигнализации в контексте живых клеток. Это дает представление о влиянии мембранной среды на рецепторы и их нисходящие сигнальные пути. Для начала поместите липидный запас в боросиликатную пробирку с помощью пипетки прямого вытеснения со стеклянным наконечником.
Поместите боросиликатную трубку на нагревательный блок, установленный на температуру приблизительно 50 градусов Цельсия, и подайте на трубку струю газообразного азота до тех пор, пока весь видимый хлороформ не испарится. Перенесите пробирку в вакуумную камеру и подвергните ее воздействию высокого вакуума в течение одного часа, чтобы удалить остатки растворителя. Затем добавьте бессывороточную среду Ham's F-12 к высушенной липидной пленке до достижения конечной концентрации 20 миллимоляров.
Накройте трубку крышкой или тефлоновой лентой и нагрейте ее на водяной бане при температуре 70 градусов Цельсия в течение пяти минут. Далее в вихревом растворе происходит суспензия липидов и образование многопластинчатых везикул или MLV. После того как среда помутнеет, перенесите весь объем в микроцентрифужную пробирку и храните его при температуре четыре градуса Цельсия до трех дней.
Смешайте приготовленные MLV с метилальфа-циклодекстрином до конечной концентрации 40 миллимоляров. Выдержите липидную смесь в течение 30 минут на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия или 55 градусов Цельсия. Наблюдайте, как носители переходят от облачного к ясному.
Затем дайте липидобменной среде остыть до комнатной температуры в течение 30-60 минут. Получите клетки рецептора инсулина яичника китайского хомяка, выращенные при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в дополненном DMEM, содержащем 4,5 грамма на литр глюкозы. Засейте семена в 1,5 раза по 10 в степени шести клеток в 60-миллиметровые пластины и инкубируйте их до получения от 80 до 90% конфлюенции.
Затем трижды промойте клетки одним миллилитром PBS. Уморите клетки на ночь двумя миллилитрами сыворотки F-12 среды. Промыв клетки трижды PBS, добавьте один миллилитр приготовленной обменной среды.
Инкубируйте клетки в течение одного часа при комнатной температуре, переворачивая каждые 15 минут, чтобы обеспечить равномерное воздействие обменных сред. Затем трижды промойте клетки одним миллилитром PBS. Полностью извлеките PBS из планшета для культивирования клеток и установите планшет под углом 45 градусов на 10 минут или до полного высыхания.
После удаления остаточного буфера добавьте в высушенные клетки один миллилитр раствора гексана изопропанола и выдержите в течение 10 минут в шейкере при комнатной температуре. Теперь переложите раствор в боросиликатную трубку. Накрыв тюбик, храните его при температуре минус 20 градусов по Цельсию.
Далее растворите оставшийся клеточный мусор, используя 500 микролитров одного обычного гидроксида натрия. Встряхните емкость в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы обеспечить полное растворение. Чтобы проверить эффективность обмена, налейте 100 миллилитров раствора хлороформаметанола 30% гидроксида аммония в стеклянный тонкослойный емкость для хроматографии.
Плотно накройте бак и дайте пару сбалансироваться не менее одного часа. Высушите образец липидного экстракта на нагревательном блоке при низкой температуре под потоком газообразного азота до тех пор, пока органический растворитель не испарится. Затем растворите липидную пленку в 50 микролитрах раствора хлороформа метанола один к одному.
С помощью шприца Hamilton объемом 10 микролитров загрузите от одного до 10 микролитров образца на высокопроизводительную пластину TLC из диоксида кремния. Наносите образец полосами по одному сантиметру, нагружая максимум 10 полос на 20-сантиметровую пластину. Поместите пластину TLC вертикально в резервуар TLC и дайте фронту растворителя пройти восемь сантиметров до отделения фосфолипидов.
Затем дайте пластине высохнуть в течение 10 минут и опрыскайте ее водным раствором из 3% ацетата меди и 8% фосфорной кислоты. Дайте тарелке снова высохнуть в течение 30 минут при комнатной температуре или с помощью термофена. Пластина должна превратиться из полупрозрачного синего в непрозрачный белый.
Затем обугливайте тарелку в духовке, температурной при температуре от 180 до 200 градусов Цельсия, в течение 5-10 минут или до тех пор, пока не станут видны черные липидные полосы. Инкубируйте обработанные клетки с 500 микролитрами 100 наномолярного инсулина в сыворотке свободной среды в течение пяти минут при комнатной температуре. После промывания клеток ледяным PBS поместите их на лед, чтобы остановить стимуляцию.
Затем добавьте один миллилитр ледяного PBS и соберите клетки с помощью скребка для клеток. Гранулируйте клетки при 3000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Затем добавьте от 100 до 200 микролитров полного буфера для лизиса RIPA в клеточную гранулу и повторно суспендируйте от 30 до 40 раз, чтобы лизировать клетки.
После инкубации лизата на льду в течение 10 минут центрифугируйте его при 16 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы отделить мусор. Соберите надосадочную жидкость в свежую пробирку. После определения концентрации белка смешайте лизат с пятикратным лаеммли буфером и нагрейте его до 95 градусов Цельсия в течение пяти минут.
Загрузите равное количество белка на образец в полиакриламидный гель додецилсульфата натрия для электрофореза. Запустите гель при напряжении от 100 до 150 вольт в буфере до тех пор, пока белки не достигнут хорошего разрешения между 100 и 250 килодальтонами. Затем перенесите растворенные белки на мембрану из поливинилиденфторида с помощью буфера для переноса и окрасьте мембрану соответствующими антителами.
Обмен липидов в ИК-клетках яичников китайского хомяка приводил к увеличению интенсивности сфингомиелиновой полосы и снижению интенсивности фосфатидилхолиновой полосы при обмене сфингомиелином мозга. И наоборот, при обмене 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина или DOPC интенсивность фосфатидилхолиновой полосы увеличивалась, в то время как интенсивность сфингомиелиновой полосы уменьшалась. Клетки, обмененные с DOPC, показали снижение инсулинозависимого ИК-аутофосфорилирования.
Напротив, сфингомиелиновые обменные клетки мозга поддерживали или умеренно увеличивали фосфорилирование ИК. Нормализованные уровни фосфорилирования определяли путем деления интенсивности ИК pYpY на интенсивность бета ИК по данным вестерн-блоттинга.
