Мы пытаемся определить наилучший метод для прогнозирования значимости антител к эритроцитам. Моноцитарно-макрофагальный анализ, по-видимому, более чувствителен, чем моноцитарный монослойный анализ. Таким образом, вопрос, на который мы пытаемся ответить, заключается в том, является ли анализ моноцитов-макрофагов лучшим анализом для прогнозирования значимости антител к эритроцитам, лучшим анализом, чем анализ монослоя моноцитов.
Экспериментальные задачи как с моноцитарным монослойным анализом, так и с моноцитарно-макрофагальным анализом заключаются в оптимизации их эффективности для обеспечения более быстрого завершения, устраняя при этом необходимость в ручной оценке фагоцитоза. Другими словами, задача состоит в том, чтобы попытаться наполовину автоматизировать эти анализы. Моноцитарный монослойный анализ, который я впервые применил в 1980 году, регулярно используется Референс-лабораторией иммуногематологии с 1983 года, чтобы помочь определить, какие ауто- или аллоантитела эритроцитов могут вызывать гемолиз при переливании донорской крови пациентам с этими антителами.
Таким образом, ММА использует моноциты в анализе, но гемолиз, опосредованный антителами, обычно вызывается макрофагами в селезенке или печени. Таким образом, здесь мы изучаем, будет ли использование первичных макрофагов в этом анализе лучше, чем моноцитов в качестве предикторов потенциальной клинической значимости антител. Попытка сделать анализ моноцитов-макрофагов более удобным для пользователя, быстрым и не требующим световой микроскопии, но, возможно, был бы желателен автоматизированный механизм считывания фагоцитоза.
Для начала разбавьте цельную кровь с помощью RPMI-1640 Complete Medium и нанесите слой на среду с градиентом плотности для центрифугирования. После центрифугирования извлеките охристую оболочку, содержащую мононуклеарные клетки периферической крови или ПМКБ. После гранулирования полученных PBMC ресуспендировать их в 10 миллилитрах предварительно подогретой среды RPMI-1640 Complete Medium.
Определите количество клеток с помощью соответствующего оборудования перед началом процесса выделения моноцитов. Следуйте инструкциям в наборе для выделения моноцитов и перенесите образец в пропиленовую пробирку соответствующего размера. Добавьте к образцу обогащающий коктейль в концентрации 50 микролитров на миллилитр образца.
После пипетирования образца вверх и вниз нанесите ему вихревой ток для тщательного перемешивания и инкубируйте образец при температуре от двух до восьми градусов Цельсия в течение 10 минут в ведре со льдом. Теперь в течение этого инкубационного периода магнетизируйте магнитные частицы в течение 30 секунд. После инкубации добавьте в образец магнитные частицы в концентрации 100 микролитров на миллилитр образца.
Сделайте образец вихревым и инкубируйте его при температуре от двух до восьми градусов Цельсия в течение пяти минут. Затем добавьте изолирующую среду, чтобы довести объем до 2,5 миллилитров или 10 миллилитров в зависимости от необходимости, с помощью градуированной пипетки и перемешайте. Далее поместите пропиленовую трубку без крышки в магнит и выдержите при комнатной температуре около 2,5 минут.
Затем возьмите в руки магнит и перевернутым одним непрерывным движением залить клеточную суспензию в новую 5 или 14 миллилитровую трубку. Ресуспендируйте выделенные клетки в среде RPMI-1640. Для начала добавьте пять миллилитров раствора поли-D-лицина в 25-миллилитровую колбу для каждой популяции макрофагов, М1 и М2, и оставьте колбы в колбе как минимум на один час.
После определения количества клеток добавьте пять миллилитров RPMI-1640 Medium, затем засейте от одного до пяти раз, по 10 в степени шести моноцитов, в каждую предварительно закодированную 25-миллилитровую колбу. Инкубируйте колбу при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом не менее двух часов. После инкубационного периода промойте колбу один раз PBS и два раза полным RPMI-1640 Medium.
Добавьте в колбу 10 миллилитров среды для дифференцировки М1 или М2 в соответствии с желаемым типом клеток и дайте клеткам дифференцироваться в инкубаторе в течение шести дней при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. На шестой день добавьте пять миллилитров поляризационной среды M1 или M2 в каждую колбу по мере необходимости. Дайте макрофагам поляризоваться в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение как минимум двух дней.
Перед сбором макрофагов М1 или М2 на восьмой день соберите надосадочную жидкость в 15-миллилитровую пробирку для дальнейшего использования, если это необходимо. Добавьте в колбу один миллилитр раствора для отслоения клеток, и инкубируйте. Чтобы остановить реакцию, добавьте в колбу три миллилитра полной среды RPMI-1640 и соберите среду в 15-миллилитровую пробирку.
Добавив в колбу еще три миллилитра среды, с помощью скребка для клеток отделите ячейки от дна. Соберите оторвавшиеся клетки в свежую пробирку объемом 15 миллилитров. Для определения качества макрофагов М1 и М2 клетки дважды промывают PBS и ресуспендируют в полной среде RPMI-1640 в 0,5 раза, 10 в степени шести клеток на пробирку.
Затем проанализируйте две популяции клеток с помощью проточной цитометрии. Подсчитайте полученные макрофаги М1 и М2 с помощью гемоцитометра в соотношении окрашивания один к одному трипановым синим. Восстановите макрофаги до концентрации 1 умножить на 10 в степени шести клеток на миллилитр в RPMI-1640 Complete Medium.
С помощью микропипетки внесите 400 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку предметного стекла с восемью лунками и инкубируйте предметное стекло при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение не менее 1,5 часов в полностью увлажненном инкубаторе для культуры тканей. Чтобы промыть RhD-положительный R2R2 эритроциты, добавьте PBS при pH 7,4 в клетки и центрифугируйте образец при 350 G в течение пяти минут. После еще двух таких промывок опсонизируйте исследуемый образец эритроцитов с антителами, представляющими интерес.
Инкубируйте антитела опсонизированных и неопсонизированных эритроцитов при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом в течение одного часа. Делайте вихрь прерывисто каждые 15 минут, чтобы предотвратить оседание эритроцитов. Затем трижды промойте эритроциты PBS при pH 7,4, как было показано ранее.
Чтобы проверить опсонизацию эритроцитов, проведите тест на непрямой антиглобулин с вторичным опсонизирующим античеловеческим антителом к первичному опсонизирующему антителу. После прочтения теста на непрямой антиглобулин восстановите промытые опсонизированные RHD плюс R2R2 эритроциты в суспензии объемом 1,25% по объему с помощью RPMI-1640 Complete Medium. После 1,5-часовой инкубации макрофагов М1 и М2 провести аспирацию и аккуратно отбросить надосадочную среду вдоль угла лунки.
Затем добавьте по 400 микролитров 1,25%-ной смеси опсонизированных эритроцитов в каждую лунку тройной установки. Инкубируйте образец при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение двух часов. Теперь налейте 100 миллилитров PBS при pH 7,4 в два стакана.
Погрузите предметное стекло в первый стакан и медленно двигайте его вперед и назад в течение 20-30 движений. Затем переложите предметное стекло на второй стакан и промойте от 20 до 30 движений. Снимите предметное стекло с PBS и промокните лишнюю жидкость на бумажное полотенце.
Погрузите предметное стекло в 100% метанол на 45 секунд, чтобы зафиксировать ячейки. Высушите слайд на воздухе и установите его с помощью подготовленного нами монтажного материала. Добавьте крышку и дайте предметному стеклу высохнуть в течение ночи перед количественной оценкой фагоцитоза.
Макрофаги M1 и M2 были успешно поляризованы и культивированы в течение восьми дней с отчетливыми морфологическими особенностями, наблюдаемыми на микроскопических изображениях. При проточной цитометрии макрофаги M1 демонстрировали около 86,1% экспрессии CD80 и 0,17% экспрессии CD209. Макрофаги M2 показали 97,3% экспрессии CD209 и 0,003% экспрессии CD80.
Гистограммы интенсивности флуоресценции подтвердили более высокую экспрессию CD80 в макрофагах М1 по сравнению с макрофагами М2. В то время как макрофаги M2 показали значительно более высокую экспрессию CD209 по сравнению с макрофагами M1. Макрофаги М2 продемонстрировали достоверно более высокий фагоцитарный индекс по сравнению с макрофагами М1.
Микроскопические изображения показали явные доказательства увеличения фагоцитоза в макрофагах М2 по сравнению с макрофагами М1. Это исследование было направлено на оценку потенциала использования макрофагов вместо моноцитов для прогнозирования значимости антител к эритроцитам. Из этой таблицы видно, что макрофаги М2 фагоцитозы лучше, чем макрофаги М1 или моноциты с антителами, считающимися клинически значимыми.
Таким образом, при дальнейшем изучении можно использовать анализ с использованием макрофагов М2 для лучшего прогнозирования клинической значимости антител.
