אנו מנסים לקבוע את השיטה הטובה ביותר לשימוש לחיזוי משמעות הנוגדנים של כדוריות הדם האדומות. נראה כי בדיקת המונוציטים-מקרופאגים רגישה יותר מבדיקת המונוציטים החד-שכבתיים. אז השאלות שאנו מנסים לענות עליהן הן האם בדיקת מונוציטים-מקרופאגים היא בדיקה טובה יותר לחיזוי משמעות נוגדנים של כדוריות דם אדומות, טובה יותר מבדיקת מונוציטים חד-שכבתיים.
אתגרים ניסיוניים הן בבדיקת מונוציטים חד-שכבתיים והן בבדיקת מונוציטים-מקרופאגים מייעלים את יעילותם כדי לאפשר השלמה מהירה יותר, תוך ביטול הצורך בהערכת פגוציטוזיס ידנית. במילים אחרות, האתגר הוא לנסות להפוך את הבדיקות הללו לאוטומטיות למחצה. הבדיקה החד-שכבתית של מונוציטים, שאותה פיתחתי למעשה, ב-1980, שימשה באופן שגרתי על ידי מעבדת הייחוס האימונוהמטולוגית מאז 1983 כדי לעזור להחליט לאילו נוגדנים אוטומטיים או אלו-נוגדנים של תאי דם אדומים יש פוטנציאל לגרום להמוליזה כאשר דם התורם מועבר לחולים עם נוגדנים אלה.
אז ה-MMA משתמש במונוציטים בבדיקה, אבל המוליזה מתווכת נוגדנים נגרמת בדרך כלל על ידי מקרופאגים בטחול או בכבד. אז כאן אנו בוחנים אם השימוש במקרופאגים ראשוניים בבדיקה זו יהיה טוב יותר ממונוציטים כמנבאים בעלי משמעות קלינית פוטנציאלית של נוגדנים. ניסיון להפוך את בדיקת המונוציטים-מקרופאגים לידידותית יותר למשתמש, מהירה יותר ואינה דורשת מיקרוסקופ אור, אך אולי רצוי מנגנון אוטומטי לקריאת הפגוציטוזיס.
כדי להתחיל, יש לדלל את כל הדם עם RPMI-1640 Complete Medium, ולשכב אותו על מדיום שיפוע צפיפות לצנטריפוגה. לאחר צנטריפוגה, אחזר את מעיל הבאפי המכיל תאים חד-גרעיניים בדם היקפי או PMBCs. לאחר הטלת ה-PBMCs שהתקבלו, השעו אותם מחדש ב-10 מיליליטר של RPMI-1640 Complete Medium מחומם מראש.
קבע את מספר התא באמצעות ציוד מתאים לפני שתתחיל בתהליך בידוד המונוציטים. עקוב אחר הוראות ערכת בידוד המונוציטים והעבר את הדגימה לצינור פרופילן בגודל מתאים. מוסיפים לדגימה את קוקטייל ההעשרה בריכוז של 50 מיקרוליטר למיליליטר מהדגימה.
לאחר פיפטינג הדגימה למעלה ולמטה, מערבל אותה לערבב היטב ומדגר את הדגימה בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בדלי קרח. כעת, מערבל את החלקיקים המגנטיים למשך 30 שניות במהלך תקופת הדגירה הזו. לאחר הדגירה יש להוסיף לדגימה חלקיקים מגנטיים בריכוז של 100 מיקרוליטר למיליליטר דגימה.
מערבלים את הדגימה ודוגרים אותה בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן הוסיפו את מדיום הבידוד כדי למלא את הנפח ל-2.5 מיליליטר או 10 מיליליטר לפי הצורך, באמצעות פיפטה מדורגת, וערבבו. לאחר מכן, הכניסו את צינור הפרופילן ללא מכסהו למגנט ודגרו בטמפרטורת החדר למשך כ -2.5 דקות.
לאחר מכן, הרם את המגנט והפוך בתנועה רציפה אחת כדי לשפוך את תרחיף התא לתוך צינור חדש של 5 או 14 מיליליטר. השעו מחדש את התאים המבודדים ב-RPMI-1640 Medium. כדי להתחיל, הוסף חמישה מיליליטר של תמיסת פולי-D-ליצין לבקבוק של 25 מיליליטר לכל אוכלוסיית מקרופאגים, M1 ו-M2, והשאיר את הצלוחיות במכסה המנוע למשך שעה אחת לפחות.
לאחר קביעת ספירת התאים, הוסף חמישה מיליליטר של RPMI-1640 Medium, ואז זרע בין פעם אחת לחמש פעמים, 10 בחזקת שישה מונוציטים לכל בקבוק מקודד מראש של 25 מיליליטר. דגרו את הבקבוק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך שעתיים לפחות. לאחר תקופת הדגירה יש לשטוף את הבקבוק פעם אחת עם PBS, ופעמיים עם RPMI-1640 Medium מלא.
הוסיפו לבקבוק 10 מיליליטר של מדיום התמיינות M1 או M2 בהתאם לסוג התא הרצוי, ותנו לתאים להתמיין בחממה במשך שישה ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. ביום השישי, הוסף חמישה מיליליטר של מדיום קיטוב M1 או M2 לכל בקבוק לפי הצורך. תנו למקרופאגים לקטב בחממה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך יומיים לפחות.
לפני קצירת מקרופאגים M1 או M2 ביום השמיני, אספו את הסופרנטנט לתוך שפופרת של 15 מיליליטר לשימוש נוסף, במידת הצורך. הוסף מיליליטר אחד של תמיסת ניתוק תאים לבקבוק, ודגירה. כדי לעצור את התגובה, הוסף שלושה מיליליטר של RPMI-1640 Medium שלם לבקבוק ואסוף את המדיה לתוך צינור של 15 מיליליטר.
לאחר הוספת עוד שלושה מיליליטר מדיום לבקבוק, השתמש במגרד תאים כדי לנתק את התאים מלמטה. אוספים את התאים המנותקים בצינור טרי של 15 מיליליטר. כדי לקבוע את האיכות של מקרופאגים M1 ו-M2, יש לשטוף את התאים פעמיים עם PBS ולהשעות מחדש ב-RPMI-1640 Medium מלא ב-0.5 פעמים, 10 בחזקת שישה תאים לצינור.
לאחר מכן, נתח את שתי אוכלוסיות התאים באמצעות בדיקת זרימה ציטומטרית. ספרו את המקרופאגים M1 ו-M2 שהתקבלו באמצעות המוציטומטר ביחס צביעה של אחד לאחד עם טריפאן כחול. להרכיב מחדש את המקרופאגים לריכוז של 1 כפול 10 בחזקת שישה תאים למיליליטר במדיום השלם RPMI-1640.
בעזרת מיקרו פיפטה, זרעו 400 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר של מגלשת שמונה תא הבאר ודגרו את המגלשה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 1.5 שעות לפחות בחממת תרבית רקמות לחה לחלוטין. כדי לשטוף את RBCs R2R2 חיוביים ל-RhD, הוסף PBS ב-pH 7.4 לתאים וצנטריפוגה את הדגימה ב-350 גרם למשך חמש דקות. לאחר שתי שטיפות נוספות כאלה, יש להעניק לדגימת ה-RBC הבדיקה נוגדנים מעניינים.
דגרו על תאי הדם האדומים האופסונים והלא אופסוניים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך שעה. מערבולת לסירוגין כל 15 דקות כדי למנוע מה-RBCs להתייצב. לאחר מכן שטפו את תאי הדם האדומים האופסוניזים שלוש פעמים עם PBS ב-pH 7.4 כפי שהודגם קודם לכן.
כדי לבדוק אם יש אופסוניזציה של RBC, בצע בדיקת אנטיגלובולין עקיפה עם נוגדן אנטי-אנושי אופסוניזציה משני לנוגדנים האופסוניזציה הראשוניים. לאחר קריאת מבחן האנטיגלובולין העקיף, הרכיבו מחדש RHD אופסוני שטוף בתוספת R2R2 RBCs במתלה נפח של 1.25% עם RPMI-1640 Complete Medium. לאחר הדגירה של שעה וחצי של המקרופאגים M1 ו-M2, יש לשאוב ולהשליך את המדיום העל-טבעי בעדינות לאורך פינת הבאר.
לאחר מכן הוסף 400 מיקרוליטר מתערובת ה-RBC האופסונית של 1.25% לכל באר של ההתקנה המשולשת. דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך שעתיים ללא הפרעה. כעת שפכו 100 מיליליטר PBS ב-pH 7.4 לשתי כוסות.
טבלו את השקופית בכוס הראשונה והזיזו אותה קדימה ואחורה לאט למשך 20 עד 30 פעימות. לאחר מכן, העבירו את השקופית לכוס השנייה ושטפו במשך 20 עד 30 פעימות. הסר את השקופית מה-PBS וטפטף עודפי נוזלים על מגבת נייר.
טבלו את השקופית ב-100% מתנול למשך 45 שניות כדי לתקן את התאים. יבש את המגלשה באוויר והרכיב אותה באמצעות אמצעי הרכבה שהוכן בבית. הוסף את פתק הכיסוי ואפשר לשקופית להתייבש למשך הלילה לפני כימות הפגוציטוזיס.
מקרופאגים M1 ו-M2 קוטב בהצלחה ותורבת במשך שמונה ימים עם מאפיינים מורפולוגיים מובהקים שנצפו בתמונות מיקרוסקופיה. בציטומטריית הזרימה, מקרופאגים M1 הראו כ-86.1% ביטוי של CD80 ו-0.17% ביטוי של CD209. מקרופאגים M2 הראו 97.3% מביטוי CD209 ו-0.003% מביטוי CD80.
היסטוגרמות של עוצמת הקרינה אישרו ביטוי CD80 גבוה יותר במקרופאגים M1 בהשוואה למקרופאגים M2. בעוד שמקרופאגים M2 הראו ביטוי CD209 גבוה משמעותית בהשוואה למקרופאגים M1. מקרופאגים M2 הראו אינדקס פגוציטי גבוה משמעותית בהשוואה למקרופאגים M1.
תמונות מיקרוסקופיה הראו עדות ברורה לעלייה בפגוציטוזיס במקרופאגים M2 בהשוואה למקרופאגים M1. מחקר זה נועד להעריך את הפוטנציאל של שימוש במקרופאגים במקום מונוציטים כדי לחזות את משמעות הנוגדנים של כדוריות הדם האדומות. טבלה זו מראה כי מקרופאגים M2 פגוציטוז טוב יותר ממקרופאגים M1 או מונוציטים עם נוגדנים הנחשבים משמעותיים מבחינה קלינית.
לפיכך, עם מחקר נוסף, ניתן להשתמש בבדיקה באמצעות מקרופאגים M2 לחיזוי טוב יותר של המשמעות הקלינית של נוגדנים.
