Stiamo cercando di determinare il metodo migliore da utilizzare per la previsione del significato degli anticorpi dei globuli rossi. Il test dei monociti-macrofagi sembra essere più sensibile del test dei monostrati dei monociti. Quindi la domanda a cui stiamo cercando di rispondere è se il test dei monociti-macrofagi sia un test migliore per la previsione del significato degli anticorpi dei globuli rossi, migliore del test del monostrato dei monociti.
Le sfide sperimentali sia con il test monostrato dei monociti che con il test dei monociti-macrofagi consistono nell'ottimizzarne l'efficienza per consentire un completamento più rapido, eliminando al contempo la necessità di una valutazione manuale della fagocitosi. In altre parole, la sfida consiste nel cercare di semi-automatizzare questi saggi. Il test monostrato dei monociti, di cui sono stato pioniere nel 1980, è stato utilizzato di routine dal Laboratorio di Riferimento di Immunoematologia dal 1983 per aiutare a decidere quali autoglobuli rossi o alloanticorpi hanno il potenziale di causare emolisi quando il sangue del donatore viene trasfuso in pazienti con questi anticorpi.
Quindi l'MMA utilizza i monociti nel test, ma l'emolisi mediata da anticorpi è tipicamente causata da macrofagi nella milza o nel fegato. Quindi qui stiamo esplorando se l'uso di macrofagi primari in questo test sarebbe migliore dei monociti come predittori di potenziale significato clinico anticorpale. Cercando di rendere il test monociti-macrofagi più facile da usare, più veloce e che non richieda la microscopia ottica, ma forse un meccanismo automatizzato per la lettura della fagocitosi sarebbe auspicabile.
Per iniziare, diluire il sangue intero con RPMI-1640 Complete Medium e sovrapporlo su un terreno a gradiente di densità per la centrifugazione. Dopo la centrifugazione, recuperare il buffy coat contenente cellule mononucleate del sangue periferico o PMBC. Dopo aver pellettato i PBMC ottenuti, risolubilizzarli in 10 millilitri di RPMI-1640 Complete Medium preriscaldato.
Determinare il numero di cellule utilizzando l'attrezzatura appropriata prima di iniziare il processo di isolamento dei monociti. Seguire le istruzioni del kit di isolamento dei monociti e trasferire il campione in una provetta di propilene di dimensioni adeguate. Aggiungere il cocktail di arricchimento al campione a una concentrazione di 50 microlitri per millilitro di campione.
Dopo aver pipettato il campione su e giù, agitarlo per mescolarlo accuratamente e incubare il campione a una temperatura compresa tra due e otto gradi Celsius per 10 minuti in un secchiello per il ghiaccio. Ora, agita le particelle magnetiche per 30 secondi durante questo periodo di incubazione. Dopo l'incubazione, aggiungere particelle magnetiche al campione a una concentrazione di 100 microlitri per millilitro di campione.
Agitare il campione e incubarlo a una temperatura compresa tra due e otto gradi Celsius per cinque minuti. Quindi aggiungere il mezzo isolante per rabboccare il volume a 2,5 millilitri o 10 millilitri secondo necessità, utilizzando una pipetta graduata, e mescolare. Quindi, posizionare la provetta di propilene senza coperchio nel magnete e incubare a temperatura ambiente per circa 2,5 minuti.
Quindi, sollevare il magnete e capovolgerlo con un movimento continuo per versare la sospensione cellulare in un nuovo tubo da 5 o 14 millilitri. Risospendere le celle isolate in RPMI-1640 Medium. Per iniziare, aggiungere cinque millilitri di soluzione di poli-D-luccina a un pallone da 25 millilitri per ogni popolazione di macrofagi, M1 e M2, e lasciare i palloni nella cappa per almeno un'ora.
Dopo aver determinato la conta cellulare, aggiungere cinque millilitri di RPMI-1640 Medium, quindi seminare da una a cinque volte, 10 alla potenza di sei monociti in ogni fiaschetta da 25 millilitri precodificata. Incubare il pallone a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per almeno due ore. Dopo il periodo di incubazione, lavare il pallone una volta con PBS e due volte con RPMI-1640 Medium completo.
Aggiungere 10 millilitri di terreno di differenziazione M1 o M2 al pallone in base al tipo di cellula desiderato e lasciare che le cellule si differenzino nell'incubatore per sei giorni a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Il sesto giorno, aggiungere cinque millilitri di mezzo di polarizzazione M1 o M2 a ciascun pallone, se necessario. Lascia polarizzare i macrofagi nell'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per almeno due giorni.
Prima di raccogliere i macrofagi M1 o M2 l'ottavo giorno, raccogliere il surnatante in una provetta da 15 millilitri per un ulteriore utilizzo, se necessario. Aggiungere un millilitro di soluzione per il distacco cellulare al pallone e incubare. Per fermare la reazione, aggiungere tre millilitri di RPMI-1640 Medium completo al pallone e raccogliere il terreno in un tubo da 15 millilitri.
Dopo aver aggiunto altri tre millilitri di terreno al pallone, utilizzare un raschietto per staccare le cellule dal fondo. Raccogliere le cellule staccate in una provetta fresca da 15 millilitri. Per determinare la qualità dei macrofagi M1 e M2, lavare le cellule due volte con PBS e risospendere in completo terreno RPMI-1640 a 0,5 volte, 10 alla potenza di sei cellule per provetta.
Quindi, analizzare le due popolazioni di cellule utilizzando un test di citometria a flusso. Contare i macrofagi M1 e M2 ottenuti utilizzando un emocitometro in un rapporto di colorazione uno a uno con il blu di tripano. Ricostituire i macrofagi a una concentrazione di 1 x 10 alla potenza di sei cellule per millilitro in RPMI-1640 Complete Medium.
Utilizzando una micropipetta, seminare 400 microlitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto del vetrino a otto pozzetti e incubare il vetrino a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per almeno 1,5 ore in un incubatore per colture tissutali completamente umidificato. Per lavare i globuli rossi R2R2 RhD positivi, aggiungere PBS a pH 7,4 alle cellule e centrifugare il campione a 350 G per cinque minuti. Dopo altri due lavaggi di questo tipo, opsonizzare il campione di globuli rossi di prova con gli anticorpi di interesse.
Incubare i globuli rossi opsonizzati e non opsonizzati anticorpali a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per un'ora. Agitare a intermittenza ogni 15 minuti per evitare che i globuli rossi si depositino. Quindi lavare i globuli rossi opsonizzati tre volte con PBS a pH 7,4 come dimostrato in precedenza.
Per verificare l'opsonizzazione dei globuli rossi, eseguire un test antiglobulina indiretto con un anticorpo anti-umano opsonante secondario contro l'anticorpo opsonante primario. Dopo aver letto il test dell'antiglobulina indiretta, ricostituire RHD opsonizzato lavato più globuli rossi R2R2 in una sospensione all'1,25% di volume per volume con RPMI-1640 Complete Medium. Dopo l'incubazione di 1,5 ore dei macrofagi M1 e M2, aspirare e scartare delicatamente il mezzo surnatante lungo l'angolo del pozzetto.
Quindi aggiungere 400 microlitri della miscela di globuli rossi opsonizzati all'1,25% a ciascun pozzetto della configurazione triplicata. Incubare il campione a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per due ore indisturbato. Versare ora 100 millilitri di PBS a pH 7,4 in due becher.
Immergere il vetrino nel primo bicchiere e muoverlo avanti e indietro lentamente per 20-30 colpi. Quindi, trasferire il vetrino nel secondo bicchiere e lavare per 20-30 colpi. Rimuovere il vetrino dal PBS e tamponare il liquido in eccesso su un tovagliolo di carta.
Immergere il vetrino in metanolo al 100% per 45 secondi per fissare le cellule. Asciugare la guida all'aria e montarla utilizzando un mezzo di montaggio preparato internamente. Aggiungere il vetrino coprioggetti e lasciare asciugare il vetrino per una notte prima di quantificare la fagocitosi.
I macrofagi M1 e M2 sono stati polarizzati e coltivati con successo per otto giorni con caratteristiche morfologiche distinte osservate nelle immagini al microscopio. Nella citometria a flusso, i macrofagi M1 hanno mostrato circa l'86,1% di espressione di CD80 e lo 0,17% di CD209. I macrofagi M2 mostravano il 97,3% di espressione di CD209 e lo 0,003% di espressione di CD80.
Gli istogrammi dell'intensità della fluorescenza hanno confermato una maggiore espressione di CD80 nei macrofagi M1 rispetto ai macrofagi M2. Mentre i macrofagi M2 hanno mostrato un'espressione di CD209 significativamente più elevata rispetto ai macrofagi M1. I macrofagi M2 hanno dimostrato un indice fagocitario significativamente più elevato rispetto ai macrofagi M1.
Le immagini al microscopio hanno mostrato una chiara evidenza di aumento della fagocitosi nei macrofagi M2 rispetto ai macrofagi M1. Questo studio mirava a valutare il potenziale dell'uso dei macrofagi al posto dei monociti per prevedere il significato degli anticorpi dei globuli rossi. Questa tabella mostra che i macrofagi M2 fagocitano meglio dei macrofagi M1 o dei monociti con anticorpi considerati clinicamente significativi.
Pertanto, con ulteriori studi, un test che utilizza macrofagi M2 può essere utilizzato per una migliore previsione del significato clinico degli anticorpi.
