Мы подробно описали протокол создания 3D-системы, использующей внеклеточную метрику наряду с коллагеновой для анализа формирования и экспрессии генов посредством остеогенеза. Внеклеточные метрики могут повысить прозрачность коллагенового геля одной формы, и он подходит для изучения образования дендритов для методов визуализации. Для начала медленно налейте пипетку 0,9 миллилитра базальной мембранной матрицы в новую 15-миллилитровую центрифужную пробирку на лед и отложите ее в сторону.
Затем извлекают из инкубатора зубную нить T25 культивируемых клеток IDG SW3 в четырех миллилитрах полной среды, дополненной интерфероном гамма. После удаления питательной среды промывают клетки пипеткой с рН ПБС 7,4. Затем трипсанируют клетки 0,5 миллилитрами 0,25% трипсина ЭДТА при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 секунд.
Инактивируйте трипсин, добавив 3,5 миллилитра полной среды. Перелейте четыре миллилитра пенсии по Цельсию в 15-миллилитровую центрифужную пробирку. Открутите клеточную суспензию при температуре 300 G в течение пяти минут при температуре четыре градуса Цельсия.
После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте клеточную палитру в одном миллилитре полной среды на льду. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра и отрегулируйте окончательную плотность клеток с полной средой до четырех раз по 10 до пятых клеток на миллилитр. Добавьте 0,1 миллилитра приготовленной клеточной суспензии к 0,9 миллилитрам внеклеточного матрикса, хранящегося на льду.
Хорошо перемешайте, осторожно пипетируя вверх и вниз. Аккуратно смешайте один миллилитр смеси клеточного матрикса и один миллилитр предварительно приготовленной коллагеновой, пипетируя вверх и вниз по льду. Пипеткой закапывают 0,5 миллилитра готовой смеси в каждую лунку 24-луночной планшета и инкубируют при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа до образования клеточной гелевой смеси.
После инкубации добавьте в клеточную гелевую смесь в каждую лунку по 0,5 миллилитра остеогенной среды. Чтобы начать остеогенную дифференцировку при температуре 37 градусов по Цельсию, считайте это нулевым днем. Каждые два дня заменяйте половину среды свежей остеогенной средой и продолжайте культивирование в течение 35 дней.
Достаньте растворы кальция AM и ethidium one stock из морозильной камеры и дайте им нагреться до комнатной температуры. Добавьте четыре микролитра двухмиллимолярного раствора этидия, один исходный раствор и пять микролитров четырехмиллимолярного раствора кальция AM к двум миллилитрам DPBS и хорошо перемешайте, чтобы получить два микромолярных кальция AM и четыре микромолярных этидия один в качестве рабочего раствора. Для проведения окрашивания клеток на первый и седьмой день культивирования пипетку закапывают 0,5 миллилитра рабочего раствора в лунки 24-луночного планшета и инкубируют в течение 30-45 минут при комнатной температуре для окрашивания клеточного гелевого матрикса.
Добавьте примерно 0,5 миллилитра свежего DPBS в новую чашку для культур со стеклянным дном диаметром 35 миллиметров и накройте чашку, чтобы предотвратить загрязнение или высыхание образцов. С помощью щипцов с локтевым наконечником осторожно перенесите окрашенный клеточный гелевый матрикс в культуральную чашку, содержащую DPBS, не повреждая и не срезая клеточный гелевый матрикс. Просмотр меченых клеток под лазерным конфокальным флуоресцентным микроскопом.
Поместите культуральную чашку, содержащую окрашенный клеточный гелевую матрицу, на столик микроскопа. Выберите области гелевой матрицы ячейки для сканирования через окуляр с помощью 10-кратного объектива. Чтобы настроить сканирование микроскопа, выберите оптические фильтры.
Отобразите кальций зеленым с помощью стандартного флуоресцентного полосового фильтра, а этидиевый — красным с фильтрами для йодида пропидия или техасского красного красителя. Выберите линейный режим для сканирования, затем нажмите режим съемки, чтобы установить единицы измерения Airy на один а.е. Выберите 8-битную глубину данных и разрешение изображения 1024 на 1024 пикселя.
Затем выберите шаг линии и установите скорость сканирования на пять. Чтобы собрать стек изображений Z, определите верхнее и нижнее положения гелевой матрицы ячейки для сканирования, фокусируясь через образец при непрерывном сканировании в соответствии с сигналом зеленого канала. После того, как верхняя и нижняя часть образца определены, выберите нужную рамку сканирования и начните сканирование.
Образец сканируется сверху вниз с выбранными настройками, создавая галерею изображений. Чтобы определить жизнеспособные ячейки, выделите один срез изображения. Зеленый и красный каналы обозначают живые и мертвые клетки соответственно.
Чтобы идентифицировать дендрит ячейки, выберите один зеленый канал для создания 3D-реконструкций с помощью программного обеспечения для получения изображений, серия радужных псевдоцветных изображений указывает информацию о глубине. Дендриты в нижней части отображаются красным цветом, а дендриты вверху — синим. В разные дни культивирования удаляют питательную среду и дважды промывают гели в планшете DPBS.
Добавьте в лунку 0,5 миллилитра или 4%-ного параформальдегида в DPBS, чтобы зафиксировать клеточную гелевую матрицу в планшете в течение 10 минут при комнатной температуре. Удалите параформальдегид из лунки и промойте клеточную гелевую матрицу еще два раза с помощью DPBS в планшете, как показано ранее, и оставьте 0,5 миллилитра DPBS в каждой лунке для визуализации. Поместите пластину на столик стереомикроскопа и выберите оптимальное положение через окуляр с помощью объектива 0,5x.
Изображение, полное поле изображения гелевой матрицы ячейки в пластине по отдельности с использованием автоматической экспозиции под светлым полем. На 35-й день культивирования проверьте уровень жидкого азота и запустите систему РФА. Откройте комнату для образцов и перенесите гели с помощью локтевых щипцов с пластины на середину предметного столика инструмента.
Перед использованием закройте комнату для образцов и подождите 30 минут, чтобы дать инструменту остыть. Установите время экспозиции на 35 миллисекунд. Диапазон спектра от нуля до 40 килоэлектронвольт и электрического тока до 770 микроампер для настройки захвата.
Перемещая этап образца, выберите от трех до пяти участков сканирования для анализа. Выберите элементы кальций и фосфор. Запустите обнаружение и экспортируйте результаты.
В разные дни культивирования. Дважды промойте удаленную клеточную гелевую матрицу питательной среды ледяным DPBS, как было показано ранее. Выделите общую РНК из матрикса клеточного геля с помощью метода фенолхлороформ-изоамилового спирта.
Затем обратное транскрибирование двух микрограммов общей РНК в CDNA с помощью случайных гексамерных праймеров. Поместите пробирку в амплификатор и выполните ПЦР-амплификацию. После ПЦР анализируйте изменения складок с помощью метода КТ с двумя дельта-методами.
Окрашивание живых мертвых клеток, визуализированное под конфокальным лазерным микроскопом, показало, что все клетки были кальций-положительными AM-положительными и почти не имели этидиевых клеток, что указывает на то, что гелевая система очень подходит для остеоцитогенеза. К седьмому дню клеточные дендриты постепенно расширялись в сеть в остеогенной среде. Псевдоцветное изображение культуры седьмого дня показывает клеточных андроидов на разной глубине в нижней и верхней части геля.
Получены полные полевые изображения геля с клетками и геля без клеток в 24-луночном планшете в указанные моменты времени. Прозрачность гелевого матрикса продолжала снижаться, пока он не стал непрозрачным на 35-й день, в отличие от бесклеточного гелевого матрикса. Рентгенофлуоресцентный спектр непрозрачного геля на 35-е сутки показал, что гель был полностью заполнен отложениями кальция и фосфора.
Экспрессия нескольких генов-маркеров, проанализированная методом ПЦР в реальном времени, показала, что уровни мРНК подопланина и белка дентинового матрикса непрерывно увеличивались с первого дня до 21-го дня, а уровень мРНК снижался после 21-го дня. Уровни мРНК фактора роста фибробластов 23 и склеростина постоянно повышались на всех стадиях. Коллаген один и базальная мембрана метрики геля быстро и комнатной температуры.
Поэтому все используемые наконечники и трубки должны быть предварительно охлаждены, если не указано иное. Любые интересные события во время остеогенеза можно наблюдать с помощью методов визуализации. Легче локализовать действие молекул при образовании и удлинении дендритов.
