Наша исследовательская группа в первую очередь фокусируется на перекрестных взаимодействиях между раком и иммунными клетками. Мы стремимся исследовать влияние различных биологических механизмов на эволюцию рака головы и шеи через модуляцию опухолевого иммунитета. Целью данного протокола является оценка инвазии во внеклеточном матриксе и пространственной колокализации различных типов клеток в многослойном контексте.
Преимуществом этого протокола является использование гетероссфероидов, включающих два соответствующих типа неопухолевых клеток наряду с раковыми клетками, для анализа инвазии с внеклеточным матриксом в направлении как микропористой мембраны, так и раздражителей хемотаксиса. Для начала добавьте магнитные наночастицы в клеточную суспензию и перемешайте 10 раз. Центрифугируйте клетки при температуре 400G в течение пяти минут при комнатной температуре и перемешайте 10 раз, чтобы повторно суспендировать клетки.
Затем перенесите и смешайте все клетки в новой пробирке для совместного культивирования и распределите по 100 микролитров совместно культивируемых клеток в каждую лунку планшета со сверхнизким уровнем прикрепления. Вставьте магнитное поле привода сфероида под пластину, чтобы вызвать агрегацию и образование сфероида, и поместите его в инкубатор на три часа. С помощью наконечника объемом 200 микролитров добавьте 50 микролитров ECM в центр 24-луночной микропористой мембраны.
Удалите пузырьки стерильной иглой, следя за тем, чтобы матрица равномерно покрывала поверхность мембраны. Инкубируйте мембрану в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия для образования геля. Для начала подготовьте 3D-культуру клеток и микропористую мембрану, покрытую внеклеточным матриксом.
Добавьте 500 микролитров питательной среды, дополненной 10%-ной фетальной бычьей сывороткой, в нижнюю камеру микропористой мембраны в качестве химиоаттрактанта. Затем осторожно удалите среду из образовавшихся гетеросфероидов, и аккуратно добавьте 50 микролитров свежей недобавленной среды на лунку поверх сфероида. С помощью стерильных ножниц отрежьте край 200 микролитров кончика с низким удержанием и соберите сфероид вместе с 50 микролитрами среды.
Аккуратно поместите сфероид поверх внеклеточного матрикса. Далее осторожно добавляйте 150 микролитров недобавленной среды по каплям, чтобы достичь общего объема в 200 микролитров. Поместите тарелку в инкубатор на 48 часов.
Нажмите на файл в программном обеспечении для анализа. Выберите «Открыть», затем выберите изображение и нажмите «ОК». Затем нажмите «Анализировать», а затем установите измерения, чтобы выбрать площадь, интегрированную плотность и отображаемую метку.
Нажмите на OK. Наконец, нажмите на анализ, а затем измерьте. Изображения светлого поля представляют собой сфероидальную или клеточную локализацию, идентифицируемую темными или черными конгломератами.
Изображения различных клеток показали различия в интенсивности и количестве флуоресценции на разных изображениях вдоль оси Z, что указывает на различные паттерны пролиферации и инвазии между клетками. С помощью конфокальной микроскопии были наложены различные каналы для визуализации паттернов колокализации во время инвазии. Визуальный анализ представленных репрезентативных результатов показал, что моноциты вторгаются первыми, за ними следуют опухолевые клетки, а фибробласты являются последними клетками, которые вторгаются во внеклеточный матрикс.
