פירטנו פרוטוקול להקמת מערכת תלת-ממדית באמצעות מערכת חוץ-תאית יחד עם קולגן לניתוח היווצרות וביטוי גנים באמצעות אוסטאוגנזה. מדדים חוץ-תאיים יכולים להגביר את השקיפות של הג'ל בצורת קולגן אחד והוא מתאים לחקר היווצרות הדנדריטים לטכניקות הדמיה. כדי להתחיל לאט פיפטה 0.9 מיליליטר של מטריצת קרום מרתף לתוך צינור צנטריפוגה חדש 15 מיליליטר על קרח ולשמור אותו בצד.
לאחר מכן, הסר חוט דנטלי T25 של תאים בתרבית IDG SW3 בארבעה מיליליטרים של מדיום שלם בתוספת אינטרפרון גמא מהאינקובטור. לאחר הסרת מדיום התרבית, לשטוף את התאים עם PBS pH 7.4 עם פיפטה. לאחר מכן טריפסניזציה של התאים עם 0.5 מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות.
השבתת טריפסין על ידי הוספת 3.5 מיליליטר של מדיום מלא. מעבירים ארבעה מיליליטר של פנסיון צלזיוס לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. סובבו את מתלה התא ב-300 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר השלכת supernatant, להשעות מחדש את לוח התא במיליליטר אחד של המדיום המלא על קרח. ספרו את התאים באמצעות ציטומטר המו והתאימו את צפיפות התאים הסופית עם המדיום המלא עד ארבע פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר. הוסף 0.1 מיליליטר של תרחיף התא המוכן ל -0.9 מיליליטר של המטריצה החוץ תאית הנשמרת על קרח.
מערבבים היטב על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה. ערבבו בעדינות מיליליטר אחד של תערובת מטריצת התא ומיליליטר אחד של הקולגן שהוכן קודם לכן על ידי פיטינג מעלה ומטה על הקרח. פיפטה 0.5 מיליליטר של התערובת הסופית לתוך כל באר של צלחת 24 באר לדגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי ליצור תערובת ג'ל התא.
לאחר הדגירה, להוסיף 0.5 מיליליטר של מדיום אוסטאוגני לתערובת ג'ל התא בכל באר. כדי להתחיל את התמיינות אוסטאוגנית ב 37 מעלות צלזיוס, לשקול את זה כמו יום אפס. כל יומיים, החליפו חצי מהמדיום בתווך אוסטאוגני טרי והמשיכו בגידול במשך 35 יום.
הוציאו מהמקפיא את תמיסות הסידן AM והאתידיום וואן סטוק ואפשרו להן להתחמם לטמפרטורת החדר. הוסף ארבעה מיקרוליטרים של שני מילימולרים אתידיום תמיסת מלאי אחת וחמישה מיקרוליטרים של תמיסת מלאי סידן AM של ארבעה מילימולרים לשני מיליליטר של DPBS וערבב היטב כדי לקבל שני סידן AM מיקרומולרי וארבעה אתידיום מיקרומולרי אחד כפתרון עבודה. כדי לבצע צביעת תאים ביום הראשון וביום השביעי של התרבית, פיפטה 0.5 מיליליטר של פתרון העבודה לתוך הבארות של צלחת 24 באר לדגור במשך 30 עד 45 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכתים את מטריצת ג'ל התא.
הוסיפו כ-0.5 מיליליטר של DPBS טרי לצלחת חדשה של תרבית תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ וכסו את התבשיל כדי למנוע זיהום או התייבשות של הדגימות. בעזרת מלקחיים עם קצה המרפק, העבירו בזהירות את מטריצת ג'ל התא המוכתמת לתוך צלחת התרבית DPBS מבלי לפגוע או לגזור את מטריצת ג'ל התא. הצג את התאים המסומנים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי לייזר.
מניחים את צלחת התרבית המכילה את מטריצת ג'ל התא המוכתם על במת המיקרוסקופ. בחר את האזורים של מטריצת ג'ל התא לסריקה דרך העינית באמצעות מטרה של 10x. כדי להגדיר את סריקת המיקרוסקופ, בחר את המסננים האופטיים.
ראו את הסידן כירוק עם מסנן פס פלואורסצנטי סטנדרטי ואת אתידיום אחד כאדום עם פילטרים לפרופידיום יודיד או צבע אדום טקסס. בחר את מצב הקו לסריקה, ולאחר מכן לחץ על מצב הרכישה כדי להגדיר את היחידות האווריריות ל- au אחד. בחר עומק נתונים של 8 סיביות ורזולוציית תמונה של 1024 על 1024 פיקסלים.
לאחר מכן בחר את שלב הקו והגדר את מהירות הסריקה לחמש. כדי לאסוף את ערימת התמונות Z, הגדר את המיקומים העליונים והתחתונים של מטריצת ג'ל התא לסריקה על ידי מיקוד דרך הדגימה תוך סריקה רציפה בהתאם לאות הערוץ הירוק. לאחר ציון החלק העליון והתחתון של הדגימה, בחר במסגרת הסריקה הרצויה והתחל בסריקה.
הדגימה נסרקת מלמעלה למטה, כאשר ההגדרות שנבחרו יוצרות גלריית תמונות. לזיהוי התאים הקיימים, בחרו פרוסת תמונה אחת. התעלות הירוקות והאדומות מציינות תאים חיים ומתים בהתאמה.
כדי לזהות את דנדריט התא, בחר את הערוץ הירוק היחיד כדי ליצור שחזורים תלת-ממדיים באמצעות תוכנת רכישת התמונות, סדרה של תמונות צבע מדומה בצבעי הקשת מציינות את נתוני העומק. הדנדריטים בתחתית מוצגים באדום, ואילו אלה שלמעלה מוצגים בכחול. בימים שונים של תרבית, להסיר את המדיום תרבית ולשטוף את הג'לים בצלחת פעמיים עם DPBS.
הוסף 0.5 מיליליטר או 4% paraformaldehyde ב DPBS לבאר כדי לתקן את מטריצת ג'ל התא בצלחת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הפרפורמלדהיד בבאר ושטוף את מטריצת ג'ל התא פעמיים נוספות עם DPBS בצלחת כפי שהודגם קודם לכן, והשאר 0.5 מיליליטר של DPBS בכל באר להדמיה. הניחו את הצלחת על במת מיקרוסקופ הסטריאו ובחרו את המיקום האופטימלי דרך העינית באמצעות מטרה של 0.5x.
תמונה, תצוגת השדה המלאה של מטריצת ג'ל התא בצלחת בנפרד באמצעות חשיפה אוטומטית מתחת לשדה הבהיר. ביום ה-35 של התרבית, בדקו את רמות החנקן הנוזלי והפעילו את מערכת XRF. פתחו את חדר הדגימה והעבירו את הג'לים עם מלקחיים עם מרפק מהצלחת לאמצע שלב הדגימה של המכשיר.
סגור את חדר הדגימה והמתן 30 דקות כדי לאפשר למכשיר להתקרר לפני השימוש. הגדר את זמן החשיפה ל- 35 אלפיות השנייה. הספקטרום נע בין אפס ל-40 קילו-אלקטרון וולט והזרם החשמלי ל-770 מיקרו-אמפר לרכישה.
הזזת שלב הדגימה, בחר שלושה עד חמישה אתרי סריקה לניתוח. בחר את האלמנטים סידן וזרחן. התחל את הזיהוי וייצא את התוצאות.
בימים שונים של טיפוח. יש לשטוף את מטריצת ג'ל התא שהוסרה פעמיים ב-DPBS קר כקרח כפי שהודגם קודם לכן. חלץ את סך הרנ"א ממטריצת ג'ל התא באמצעות שיטת אלכוהול איזואמיל פנול כלורופורם.
לאחר מכן תעתיק הפוך שני מיקרוגרם של RNA כולל ל- CDNA עם פריימרים הקסמרים אקראיים. מניחים את הצינור על thermocycler ולבצע הגברה PCR. לאחר PCR לנתח את השינויים קיפול עם שתי שיטות CT דלתא.
צביעת התאים המתים החיים שהודגמה במיקרוסקופ לייזר קונפוקלי הראתה שכל התאים היו חיוביים לסידן AM וכמעט ללא תאי אתידיום חיוביים אחד, מה שמצביע על כך שמערכת הג'ל מתאימה מאוד לאוסטיאוציטוגנזה. הדנדריטים התאיים התרחבו בהדרגה לרשת בתווך האוסטאוגני עד היום השביעי. תמונת צבע מדומה של תרבות היום השביעי מציגה את האנדרואידים התאיים בעומקים שונים בתחתית ובחלק העליון של הג'ל.
תמונות שדה מלא של הג'ל עם תאים וג'ל ללא תאים בצלחת 24 באר בזמנים שצוינו מצולמים. שקיפותה של מטריצת הג'ל המשיכה לרדת עד שהפכה אטומה ביום ה-35, בניגוד למטריצת הג'ל נטולת התאים. ספקטרום XRF של הג'ל האטום ביום ה-35 הצביע על כך שהג'ל היה מלא לחלוטין במרבצי סידן וזרחן.
הביטוי של מספר גני סמנים שנותחו על ידי PCR בזמן אמת הראה כי רמות ה- mRNA של פודופלנין וחלבון מטריצת דנטין אחד עלו ללא הרף מהיום הראשון עד היום ה -21 ורמת ה- mRNA ירדה לאחר היום ה -21. רמות ה-mRNA של גורם גדילה פיברובלסטי 23 וסקלרוסטין עלו ללא הרף במהלך כל השלבים. קולגן אחד וקרום המרתף ממטרי ג'ל במהירות ובטמפרטורת החדר.
לכן, כל הטיפים והצינורות המשמשים חייבים להיות מקוררים מראש, אלא אם כן צוין אחרת. ניתן לצפות בכל אירוע מעניין במהלך אוסטאוגנזה על ידי טכניקות הדמיה. קל יותר למקם את פעולת המולקולה במהלך היווצרות הדנדריטים והתארכותם.
