В этом видео мы покажем, как количественно оценить трансдукцию AAV в сетчатке мыши с использованием метода цифровой капельной ПЦР, который чрезвычайно чувствителен и делает абсолютную количественную оценку целевой ДНК. Мы разработали этот метод в основном для больших конструкций AVV, которые не позволяют нам использовать ген-репортер, такой как конструкции на основе CRISPR. Используя этот метод, мы можем просто количественно оценить скорость трансдукции AAV в сетчатке.
Этот метод основан на чувствительности и абсолютной количественной оценке цифровой капельной ПЦР и дает прямые результаты. В этом видео мы покажем, как количественно оценить трансдукцию AAV в сетчатке мыши с использованием метода цифровой капельной ПЦР, который чрезвычайно чувствителен и делает абсолютную количественную оценку целевой ДНК. Мы разработали этот метод в основном для конструкций большой площади, что не позволяет нам использовать репортерный ген, такой как конструкции на основе CRISPR.
Используя этот метод, мы можем просто количественно оценить скорость трансдукции AAV в сетчатке. Этот метод опирается на чувствительность и абсолютную количественную оценку двух капель ПЦР и дает прямые результаты. Из-за эффективности методологии цифровой капельной ПЦР несколько лабораторий уже переходят от количественной ПЦР в режиме реального времени к цифровой капельной ПЦР или титрованию AAV.
Этот метод также может обеспечить основу для количественной оценки митохондриальной ДНК в сетчатке, а также для проверки эффективности коррекции мутаций на основе CRISPR для генной терапии в сетчатке мыши. Приготовьте трансфекционную смесь с вспомогательной плазмидой AAV, плазмидой капсида AAV, вектором AAV и раствором PI в пяти миллилитрах. Добавьте пять миллилитров приготовленной трансфекционной смеси в питательные среды.
Инкубировать трансфектированные клетки при 37 градусах Цельсия. Собирайте носители через 48-60 часов после трансфекции. Переварить среду с ДНК в конечной концентрации 250 единиц на миллилитр в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия и центрифугировать ее при 4000 г четырех градусов Цельсия в течение 30 минут.
Предварительно смочите регенерированную целлюлозную мембрану PBS. Фильтруйте среду шприцевым фильтром 0,22 мкм в предварительно смачиваемую регенерированную целлюлозную мембрану на 100 кг Дальтон. Центрифугируйте регенерированную целлюлозную мембрану при 4000 Г четырех градусов Цельсия в течение 30 минут и выбросьте среду.
Промывайте и центрифугируйте регенерированную целлюлозную мембрану PBS, содержащую 0,001%, плурон F68 три раза при 4000 G четыре градуса Цельсия в течение 30 минут. Собирают концентрированные ААВс из верхней части регенерированной целлюлозной мембраны и выделяют для дальнейшего использования. Здесь мы показали, как сделать производство AAV меньшего масштаба.
После проверки этого протокола вы должны быть в состоянии сделать AVV, достаточные для того, чтобы увидеть выражение репортера в сетчатке. Вы также можете следовать протоколу цифровой ПЦР, чтобы иметь возможность титровать производимые AAV. Нанесите одну каплю 0,5% тропикамида и 2,5% фенилэфрина гидрохлорида, содержащих глазные капли, перед анестезией для расширения зрачков.
Анестезируйте мышей изофлураном и проверяйте рефлексы. Нанесите 0,3% тобрамицина и 0,1% дексаметазона стерильного офтальмологического раствора глазной капли на каждый глаз перед процедурой инъекции. Используйте хирургический крючок для стабилизации верхнего века.
Слегка оттяните назад, чтобы обнажить дорсальную часть глаза. Прикрепите крючок к ленте, чтобы удерживать его в нужном положении. Удалите конъюнктиву ножницами с изогнутой радужкой, чтобы обнажить склеру глаза.
Используйте свежий и стерильный шприц инсулина 30G для пункции склеры. Вставьте иглу микрошприца через тот же прокол с помощью микроманипулятора. Поместите кончик иглы за линзой в середину глазной чашки.
Медленно вводят один микролитр раствора ААВ в стекловидное тело глаза. Оставьте иглу на месте в течение одной минуты и медленно выньте иглу. Нанесите на чашку для глаз противовоспалительное и антибактериальное местное гель, содержащее 0,3% тобрамицина и 0,1% дексаметазона.
Применяют одну каплю с 0,5% тропикамида. И 2,5% фенилэфрина гидрохлорида, содержащего глазные капли перед анестезией для расширения зрачков. Нанесите карбамид два миллиграмма на грамм местного геля на поверхность глаз.
Отрегулируйте подставку для мыши по мере необходимости, чтобы центрировать глаз мыши. Выполните визуализацию глазного дна и флуоресценции на обоих глазах, чтобы следить за экспрессией TdTomato через неделю и две недели после интравитреальной инъекции. Усыпляйте животных, используя вдыхание углекислого газа перед процедурой.
Переместите глазное яблоко вперед с помощью щипцов сплиттера длиной 13,5 сантиметров. Снимите хрусталик вместе с оставшимся стекловидным телом. Отрежьте соединение глазного яблока с зрительным нервом с помощью прецизионных изогнутых щипцов и аккуратно сожмите сетчатку такими же изогнутыми щипцами.
Изолируйте геномную ДНК с помощью коммерциализированного набора геномной ДНК ткани на основе пленки K. Переварить сетчатку при 55 градусах Цельсия 200 г в течение 30 минут с протеиназой K.Lyse retina полностью и следовать протоколу производителя. В этих протоколах мы показали интравитреальную инъекционную визуализацию цветения глазного дна, а также выделение сетчатки и геномной ДНК.
Это очень важные процедуры для сетчатки, и, следуя этому протоколу, вы сможете вводить произведенные AAV и следить за их профилем экспрессии. И ковш этой эффективности трансдукции путем количественной оценки геномов AAV в геномной ДНК сетчатки. Здесь вы можете увидеть основное применение цифровой капельной ПЦР, где вы можете сделать абсолютную количественную оценку генома AAV, который трансдуцируется в клетках сетчатки.
Разбавляйте геномные ДНК из введенных сетчаток в 0,05% растворе плурона F 68 для достижения конечной концентрации в один нанограмм на микролитр для каждого образца. Выполните генерацию капель в реакционной смеси ПЦР объемом 20 микролитров, включая один нанограмм геномной ДНК 125 праймеров наномоляров и 2-кратную вечнозеленую суперсмесь. Загрузите смесь образцов в среднюю часть картриджа для генерации капель.
После этого добавьте 70 микролитров капельного масла в нижний ряд картриджа. Положите прокладку поверх картриджа. Убедитесь, что между прокладкой и картриджем нет зазора.
Затем поместите его в генератор капель. Осторожно возьмите примерно 40 микролитров капель, которые образуются в верхнем колоколе. Добавьте капельный раствор в полушарновую 96-луночную реакционную пластину ПЦР.
Запечатайте пластину ПЦР с помощью герметика ПЦР-пластины с помощью алюминиевой уплотнительной пленки. Поместите пластину ПЦР в 96-луночный термогерметичный термоциклер. Используйте протокол ddPCR, указанный в статье.
Поместите пластину ПЦР в капельный считыватель для анализа данных. После просмотра этого видео вы сможете выполнить базовую цифровую технику ПЦР. Вы также можете использовать напряженные клетки с незначительным количеством материала, что идеально подходит для цифровой техники ПЦР.
Однако следует тщательно корректировать целевое количество ДНК, чтобы не превышать предел цифровой капельной ПЦР. Вот блок-схема экспериментальной процедуры. Мы выполнили мелкосерийное производство AAV, за которым последовало титрование AAV.
Затем мы выполнили интравитреальную инъекцию. После этого мы количественно оценили интенсивность флуоресценции с помощью флуоресцентной визуализации глазного дна. Затем выделили сетчатку мыши и извлекли геномную ДНК из сетчатки для ddPCR.
Титрование AAV также имеет решающее значение для правильной количественной оценки трансдукции AAV. ddPCR зависит от генерации капель, которые разбавляют мишень AAV геном. Репрезентативные результаты ddPCR показывают положительные и отрицательные капли для генома AVV.
Положительный выше порога, а отрицательный ниже. После умножения на коэффициенты разбавления было обнаружено, что титр AAV составляет от 10 до 12 копий генома на миллилитр. Чтобы правильно количественно оценить эффективность трансдукции AAV, было введено несколько сетчаток.
Введенные животные были изображены, и была рассчитана средняя интенсивность флуоресценции. Через две недели сетчатка была изолирована. А ddPCR выполнялся с использованием праймеров WPRE и 18 S.
Интенсивность флуоресценции вводимых AAV сетчаток коррелировала с расчетами генома AAV, показывая силу методологии. Здесь мы показали несколько методов, в том числе мелкомасштабную интравитреальную инъекцию препарата AAV.
