Для изучения морфогенеза нейронов требуется одноклеточная маркировка и визуализация дендритарных или аксональных беседок. Маркируя развивающиеся беседки минимально инвазивным способом, ткань сетчатки остается здоровой и подходящей для длительной конфокальной живой визуализации. Основным преимуществом данного метода является возможность визуализации отдельных беседок с многоцветными флуоресцентными белками в течение четырех дней после инъекции.
Это делает возможным изучение морфологии неонатальной беседки. Этот протокол визуализации и анализа инъекций может быть использован для изучения морфологии нейронов в центральной нервной системе. Соответствующий выбор Cre и место инъекции должны быть определены для нацеливания на интересующую популяцию клеток.
Начните с выбора линии мыши Cre, чтобы пометить интересующие популяции клеток сетчатки. Получают рекомбиназно-зависимый вирус AAV, кодирующий флуоресцентные белки. Для оптимальной маркировки тонких процессов выбирайте векторы, которые экспрессируют модифицированные флуоресцентные белки, нацеленные на плазматическую мембрану.
Для аликвоты AAV на льду и приготовьте разбавление от одного до четырех AAV с использованием стерильного физиологического раствора или PBS. Чтобы визуализировать инъекции, окрасьте раствор в синий цвет, добавив примерно один микролитр 0,02% раствора красителя FAST Green FCF на каждые 15 микролитров разведения AAV. Стерилизуют область инъекции 70% этанолом.
Засыпьте микропипетку разбавлением AAV с помощью микрошприца. Под стереомикроскопом разбейте наконечник микропипетки иглой 30-го калибра, чтобы распечатать наконечник. После обезболивания неонатальных мышей татуируйте их подушечки лап чернилами для татуировки, используя иглу 30-го калибра для идентификации животных.
Собирайте обрезки хвоста для выделения ДНК и генотипирования. Смажьте кожу, покрывающую глаза, 70% этанолом. Используйте иглу 30-го калибра, чтобы открыть сросшееся веко, применяя легкое давление пальцами, чтобы открыть глаз.
Проткните небольшое отверстие через роговицу в соединении роговицы. Вставьте стеклянную микропипетку в отверстие и нажмите на ножную педаль микроинжектора два-четыре раза, чтобы ввести AAV в интравитреальное пространство. Медленно удалите микропипетку и подтвердите инъекцию AAV, визуализируя синий краситель в зрачке.
После приготовления aCSF сетчатки, как описано в тексте рукописи, насытите оксигеном aCSF сетчатки, пузыря карбогеном в течение минимум 15 минут, затем отрегулируйте рН до 7,4. Вставьте чашку Петри диаметром 60 миллиметров в лоток для льда и наполните ее насыщенным кислородом сетчаткой aCSF. Поместите заполненную чашку Петри под стереомикроскоп.
Затем отрежьте лоскут век усыпленной мыши, чтобы обнажить глаз. Используйте тупые щипцы для энуклеации глаз и переноса их в холодную сетчатку aCSF, помещенную под стереомикроскоп. Под стереомикроскопом стабилизируйте глаз, обхватив зрительный нерв с помощью щипцов числа пять Дюмона и проткните отверстие в центре роговицы иглой 30 калибра, затем вставьте один кончик микроножек в отверстие, чтобы сделать разрез от отверстия до конца роговицы.
Повторите, чтобы сделать четыре среза по сторонам света, создав четыре створки. Схватите и раздвиньте два соседних лоскута, аккуратно отшелушивая склеру от сетчатки для всех лоскутов роговицы. Затем снимите хрусталик с чашечки сетчатки с помощью щипцов.
Наконец, используйте микроножницы, чтобы сделать четыре радиальных разреза от края сетчатки к зрительному нерву, создав четыре равных лепестка. Если для монтажа используются серые мембранные фильтры MCE большого диаметра, разрежьте диск на квадранты примерно на один сантиметр в поперечнике, а затем поместите диск MCE в центр более крупной белой фильтровальной бумаги. Используя две кисти третьего размера на ноль, переверните одну чашку сетчатки на кисть с ганглиями сетчатки стороной вниз.
Осторожно поднимите сетчатку из aCSF, убедившись, что натяжение воды не разрывает сетчатку. Все еще удерживая кисть с сетчаткой, переместите чашку Петри, содержащую aCSF, в сторону и поместите белую фильтровальную бумагу с мембраной MCE под стереоскоп. Используя трансферную пипетку, поместите каплю aCSF в центр фильтровальной бумаги MCE.
Поместите сетчатку в каплю aCSF, созданную поверхностным натяжением и заряженной мембраной MCE. Используйте кисти, чтобы расположить сетчатку внутри капли с ганглиозной клеткой сетчатки стороной вверх, затем разверните четыре лепестка. После позиционирования создайте водный мост между кистью и белой фильтровальной бумагой, чтобы разрушить поверхностное натяжение капли.
Соберите инкубационную камеру с живым изображением и заполните ее насыщенной кислородом aCSF. Включите насос и регулятор температуры, следя за тем, чтобы температура не поднималась выше 34 градусов по Цельсию. Для стабилизации температуры в камере может потребоваться до часа.
Рекомендуется установить инкубационную камеру перед началом рассечения сетчатки. Стабильная температура камеры помогает уменьшить дрейф образцов. Чтобы перенести плоскую насыпь сетчатки в перфузионную камеру, остановите насос и удалите aCSF, который находится в камере.
Затем поместите диск MCE с плоским креплением сетчатки в инкубационную камеру. Предварительно смочите вес образца, чтобы преодолеть поверхностное натяжение, затем поместите его на плоское крепление, гарантируя, что вес образца помещается на бумагу MCE для уменьшения дрейфа образца. Наполните камеру нагретым aCSF и циркулируйте aCSF со скоростью примерно один миллилитр в минуту.
Поместите носовую часть с 25-кратным водоопрокидывающим объективом в камеру визуализации. Экран для метких клеток, представляющих интерес, с использованием эпифлуоресцентного света и регулировка объема изображения для захвата дендритных особенностей, представляющих интерес. Используя таблицу подстановки, которая идентифицирует как перенасыщенные, так и недонасыщенные пиксели, настройте мощность лазера таким образом, чтобы ни один пиксель не был перенасыщен.
Получение объема 3D-изображения и повторная съемка с требуемой частотой кадров. Объем изображения можно регулировать между каждой точкой времени, чтобы компенсировать дрейф образца. Импортируйте серию изображений, разбивая изображения по времени.
Сохраняйте все точки времени вручную или с помощью плагина макросов. Создайте теоретическую функцию разброса точек с помощью плагина ImageJ, щелкнув Defraction PSF 3D, числовая диафрагма объектива, длина волны флуорофорного излучения, размер пикселя и Z-интервал необходимы для создания точного PSF. Выберите плагины, макросы и запустите для выполнения пакетной параллельной итеративной деконволюции для всех временных точек с использованием предоставленного макроса.
Импортируйте все деконволюционные временные точки в виде стека, щелкнув файл, импорт, а затем последовательность изображений. Преобразуйте стек в гиперстек, щелкнув изображение, гиперстеки, а затем стеки в гиперстек. Добавьте количество Z-срезов и таймфреймов, затем исправьте 3D-дрейф с помощью правильного плагина 3D-дрейфа.
Сохраните гиперстек с исправленным 3D-дрейфом и преобразуйте изображение обратно в обычный стек, щелкнув изображение, гиперстеки, гиперстек в стек, а затем разделите временные точки, щелкнув изображение, стеки, инструменты и сплиттер стеков. Чтобы указать количество разделенных подстеков, введите количество точек времени. Используйте пакетную обработку для создания максимальной проекции для всех временных точек.
Импортируйте последовательность изображений замедленной съемки, щелкнув файл, импорт, затем последовательность изображений. И использовать обычные инструменты ImageJ для желаемого анализа деконволюционного и постобработанного двухмерного видео, Было получено, деконволюционно и скорректировано для 3D-дрейфа 3D-видео с высоким разрешением развивающихся дендритов звездообразующих клеток. Были получены максимальные проекции Z-плоскости для создания 2D-видео для анализа, показывающие область дендритной утонченности и область дендритного роста.
3D-деконволюция каждой точки времени увеличивала разрешение тонких проекций филоподий одиночной амакриновой ячейки P6 до и после деконволюции с ImageJ. Длительные периоды заражения AAV не обязательно приводят к увеличению флуоресцентного сигнала, о чем свидетельствуют аналогичные уровни экспрессии белка через пять и 11 дней после инъекции. Важно уменьшить дрейф образцов во время визуализации.
Дрейф сводится к минимуму за счет поддержания постоянной температуры изображения и надлежащего позиционирования веса на образце. Если происходит дрейф, ручное получение временных рядов позволяет регулировать объем изображения между кадрами. Это гарантирует, что интересующие особенности останутся в кадре.
Этот протокол создает 3D-видео с высоким разрешением, деконволюцией и дрейфом разработки нейритов. Такие видео приводят к лучшему пониманию нейронной проводки и необходимы для продвижения методов вычислительного анализа 3D-морфогенеза. Для достижения высокопроизводительного анализа разработки нейритов требуется более совершенное программное обеспечение для автоматического отслеживания и отслеживания.
