Это обеспечивает высококачественные результаты метаболизма инозитолфосфата во всех организмах, которые мы тестировали до сих пор. Это также даст представление о новом клеточном биосинтетическом пути, о котором мы в настоящее время знаем. Анализ метаболизма инозитолфосфата с помощью CE-ESI-MS является более быстрым, высокочувствительным и способным обеспечить структурную информацию для сборок инозитолфосфата.
Для начала настройте масс-спектрометрию капиллярного электрофореза electrospray Ionization Mass Spectrometry или CE-ESI-MS, состоящую из коммерческой системы CE и тройного квадрупольного тандемного масс-спектрометра, оснащенного источником Agilent Jet Stream ESI. Затем соедините разветвитель потока оболочки 1:100 и выходное отверстие изократического жидкостного хроматографического насоса и убедитесь, что входной флакон системы CE находится на той же высоте, что и наконечник опрыскивателя анализатора массы. Затем используйте версию MassHunter Workstation или аналогичное программное обеспечение MS для управления всей системой, а также сбора и анализа данных.
После подготовки рабочего буфера CE и оболочки жидкости установите жидкость оболочки, продувая со скоростью пять миллилитров в минуту в течение пяти минут. Затем установите расход на один миллилитр в минуту, а давление насоса на 180 бар. Убедитесь, что переработанная трубка подключается обратно к жидкому баллону оболочки для повторного использования растворителя.
Далее, используя капиллярный колонкорез с вращающимся алмазным лезвием, правильно вырежьте оба конца капилляра CE-MS с помощью окна обнаружения ультрафиолета. Затем снимите два-три сантиметра полиимидного покрытия с обоих концов зажигалкой, а поверхность капилляров очистите изопропанолом. Чтобы установить капилляр, сопоставьте капилляр с кассетой CE-MS.
Затем нажмите кнопку «Изменить кассету» и установите кассету в устройство CE. Чтобы активировать капилляр, сначала промывайте капилляр одним молярным гидроксидом натрия, затем водой в течение 10 минут, а затем СЕ работает буфер в течение 15 минут. Затем вставьте капилляр в распылитель CE-MS.
Используя увеличительное стекло и регулировочный шнек в опрыскивателе, точно отрегулируйте капиллярное отверстие, гарантируя, что капиллярный конец выступает примерно на 0,1 миллиметра из наконечника опрыскивателя. Проверьте стабильность опрыскивателя ESI в режиме полной проверки. Флуктуация суммарных ионных электроферограмм должна быть в пределах 5%, после чего выполняют тестовый прогон со стандартами инозитолфосфата.
После приготовления внутренней эталонной смеси смешайте 10 микролитров образца с 0,5 микролитрами внутренней эталонной смеси и флаконом образца CE. При использовании системы пополнения нажмите на кнопку Изменить бутылку. Поместите подготовленные 250 миллилитров рабочего буфера CE в бутылку с электролитом.
Затем нажмите «Чистые трубки», сохраняя иглу пополнения в флаконе с водой. Задайте параметры ESI и MS. Затем оптимизируйте параметры источника с помощью оптимизатора источника со смесью стандартов инозитолполифосфата и нескольких настроек мониторинга реакций с помощью MassHunter Optimizer со всеми стандартами.
Затем выполните пробежку для экстрактов инозитолфосфата и проверьте результаты. Задайте последовательность при наличии большего количества образцов. После измерения пусть MS находится в режиме ожидания и не выключайте жидкостный хроматографический насос.
Замените опрыскиватель CE-ESI-MS опрыскивателем LC-ESI-MS при отсутствии подачи жидкости в оболочку. Для анализа данных откройте программное обеспечение количественного анализа и создайте пакет для всех образцов. Затем создайте новый метод из полученных данных мониторинга множественных реакций и установите фосфаты инозитола углерода-13 в качестве внутренних стандартов.
Затем проверьте состав для мониторинга нескольких реакций, время удержания, внутренние стандарты, настройку концентрации и квалификатора. Передайте validation и Exit, чтобы применить метод к текущему пакету. Сохраните метод.
Затем проверьте, правильно ли интегрирован каждый пик в пакете. В противном случае вручную интегрируйте пик. Экспортируйте результаты в электронную таблицу и количественно оцените пирофосфаты инозитола, сравнив пиковый отклик анолита с соответствующим пиковым откликом стабильного изотопа, помеченного внутренними стандартами с известными концентрациями.
Наконец, с измеренной концентрацией в инозитолфосфате, экстракционным раствором и его объемом, рассчитывают абсолютные количества и дополнительно нормализуют количество по количеству клеток или содержанию белка. Рассчитайте клеточную концентрацию на основе количества клеток и среднего объема клеток HCT116. Здесь показаны экстрагированные ионные электроферограммы эталонов инозитолпирофосфата в концентрации двух микромолей.
Вставлен метаболизм пирофосфатов инозитола у млекопитающих с их упрощенной структурой. Здесь показан запуск CE-ESI-MS клеток HCT116 из Университетского колледжа Лондона или UCL. CE-MS использовался для количественной оценки вариаций уровней IP8 между клетками HCT116 из UCL и клетками NIH.
Клетки HCT116 из UCL содержат в семь раз более высокие уровни IP8, чем у NIH. Значительное накопление 1, 5-IP8 в ячейках HCT116 UCL сопровождается значительным увеличением 1-IP7. Анализ CE-ESI-MS клеток HCT116, обработанных фторидом натрия, из NIH продемонстрировал повышение уровня 5-IP7, а также снижение IP6 и появление 5-PPIP4.
Хотя уровни 1-IP7 снизились до некоторой степени, он не полностью отсутствует в клетках, обработанных фторидом натрия, но в основном под пределом обнаружения. Важно сформировать стабильный класс CE-ESI-MS. Мы рекомендуем проверить повторяемость и чувствительность системы перед измерениями.
Данная методика позволяет обеспечить метаболизм инозитолфосфата, имплантатов и тканей, а также дает возможность для тщательного изучения биологически значимого инозитолпирофосфата.
