PIB-MS - это новый метод, используемый для обогащения эндогенных фосфорпротеинфосфатаз, и они взаимодействуют с белками из клеток и тканей. Он включает в себя идентификацию и количественную оценку этих белков с использованием протеомики на основе масс-спектрометрии. Этот метод не требует экзогенной экспрессии меченых версий фосфорпротеинфосфатаз, которые могут изменить активность или локализацию белка.
Кроме того, он не использует антитела, которые могут быть неспецифическими или неспособными различать конкретные изоформы. Этот метод исследования PPPM может быть масштабирован для использования на всем, от клеток до клинических образцов. Для начала соберите ячейку гранулы методом центрифугирования в 277 раз г в течение двух минут при комнатной температуре.
Удалите среду и промыть клетки пятью миллилитрами PBS. Подготовьте буфер лизиса, как описано в текстовом протоколе, и держите на льду. Добавьте один миллилитр охлажденного буфера лизиса к образцам, затем гомогенизируйте образцы путем сонификации и удерживайте клетки на льду между импульсами.
Переложить лизаты в свежие 1,5-миллилитровые пробирки. Центрифугируйте обработанный ультразвуком образец в 21, 130 раз в г в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия. Используйте аликвоту лизата для количественной оценки общей концентрации белка с использованием анализа бицинхониновой кислоты.
Этот шаг необходим для обеспечения равной концентрации белка в каждом образце. Для контроля ингибитора фосфопротеинфосфатазы подготовьте для каждого образца две аликвоты равной концентрации белка. Буфер лизиса может быть использован для разбавления образцов таким образом, чтобы каждая трубка имела одинаковую концентрацию белка.
Добавьте один микромоляр свободного микроцистина-LR к одной аликвоте и равный объем ДМСО к другой. Вращайте образцы и высиживайте их на льду в течение 15 минут. Приготовление шариков ингибитора фосфатазы следует проводить заранее или во время этапов инкубации, описанных в разделе пробоподготовки.
Используйте 10 микролитров твердых шариков ингибитора фосфатазы или смолы PIB для одного миллиграмма белка и добавьте их в 1,5-миллилитровую трубку. Промыть PIB трижды с 0,5 миллилитрами буфера лизиса путем вихря с последующим центрифугированием в 376 раз в g в течение 30 секунд при комнатной температуре. Добавьте соответствующее количество буфера лизиса к промытым PIB, чтобы получить 50% по объему буферного раствора PIB.
Смешайте, аккуратно пипетировав и закрутив наконечник пипетки и суспензию, чтобы повторно суспендировать PIB. Переложите 20 микролитров суспензии в 1,5-миллилитровую трубку, содержащую 0,5 миллилитра лизисного буфера. Вращайте трубки в 376 раз в течение 30 секунд.
Каждая трубка содержит равные объемы ПИБов. Выбросьте супернатант, оставив только твердую смолу и до 50 микролитров лизисного буфера в каждой пробирке. Перенесите лизаты в соответствующие маркированные пробирки, содержащие PIB.
Инкубируйте лизат с PIB в течение одного часа при 4 градусах Цельсия с вращением при 8 оборотах в минуту. После инкубации с лизатом центрифугируют PIB в 376 раз г в течение 30 секунд при 4 градусах Цельсия и удаляют супернатант. Вымойте шарики, добавив 0,5 миллилитра буфера лизиса и перевернув трубки Соберите шарики путем центрифугирования и удалите супернатант.
Повторите этот шаг в общей сложности для трех стирок. После окончательной промывки удалите буфер лизиса как можно больше, не пипетируя PIB. Подготовьте буфер элюирования, содержащий 2%SDS, и добавьте буфер элюирования, в четыре-пять раз превышающий объем PIB.
Инкубируйте при температуре 65 градусов Цельсия в течение одного часа, чтобы элюдировать фосфопротеинфосфатазы из шариков. Центрифугируйте пробирки по 376 раз в г в течение 30 секунд при комнатной температуре. Соберите элюат в отдельную трубку и приступайте к масс-спектрометрическому анализу или вестерн-блоттингу.
Для регенерации ПИБ инкубируют их в 2%-ном растворе SDS с вращением при 8 об/мин в течение одного часа при комнатной температуре. Вымойте шарики три-пять раз в 25 миллимолярах Tris-HCl pH 7,5 с ротацией в течение 30 минут за одну стирку. Хранить PIBs в 25 миллимолярах Tris HCL pH 7,5 с азидом натрия.
Для масс-спектрометрического анализа методы фильтрации и анализа данных различаются и могут выполняться исследователем или основным объектом. После поиска необработанных данных в базе данных протеомов для конкретных видов отфильтруйте результаты поиска и экспортируйте их в виде листа Microsoft Excel. Анализируйте данные в трех экземплярах.
Для количественной оценки без маркировки используйте измерения пиковой области MS1 для количественной оценки данных. Чтобы идентифицировать субъединицы ППС и их интеракторы de novo, сравните биологические трипликаты образцов, ингибированных микроцистином-LR и обработанных ДМСО. Отфильтруйте данные таким образом, чтобы присутствовали только белки с общим количеством пептидов более одного по меньшей мере из двух из трех образцов, обработанных контролем ДМСО.
Чтобы отфильтровать белки, которые неспецифически связываются со смолой, удалите белки, в которых общее количество пептидов в состоянии, обработанном микроцистином-LR, выше, чем для любой каталитической субъединицы ППС. Исключите из анализа распространенные загрязняющие вещества, такие как кератин, коллаген, рибосомные белки и гетерогенные ядерные рибонуклеопротеины. CSV-файл необходим для импорта данных в Perseus.
Импортируйте отфильтрованные данные в Perseus, щелкнув Загрузка универсальной матрицы в разделе Загрузка. Преобразуйте данные, перейдя в раздел Базовое преобразование, выбрав данные и указав функцию преобразования в качестве базы журнала 2 из x. Вменение отсутствующих значений из нормального распределения путем перехода в раздел Условное исчисление, Замена отсутствующих значений из нормального распределения, выбор данных и указание ширины и пониженной передачи для вычисления.
Выполните квантильную нормализацию, перейдя в Нормализацию, Квантильную нормализацию. Аннотируйте данные, перейдя в строки Annot, Строки категориальной аннотации. Выполните Т-тест студента, перейдя в Тесты, Тесты с двумя образцами, выбрав группы, тест для выполнения и метод для множественной коррекции проверки гипотез, используемый для усечения.
Эта функция также вычисляет логарифмические соотношения 2. Фосфопротеинфосфотаты и их интеракторы были идентифицированы в клетках HeLa с использованием эксперимента PIB с удалением PIB, за которым последовала количественная оценка содержания белка без маркировки в образцах, обработанных DMSO и микроцистином-LR. Вулканический график масс-спектрометрического анализа идентифицировал специфические связующие PIB, показанные красным цветом, каталитические субъединицы синим цветом и новые потенциальные субъединицы PPP, или взаимодействующие белки, белым.
Неспецифические связующие были показаны серым цветом. Точечный график области log2 из обработанного DMSO лизата клеток HeLa показал, что обилия были сильно коррелированы, что указывает на воспроизводимость данных. Сетевой анализ всех субъединиц фосфорпротеинфосфатазы и взаимодействующих белков показал, что эти белки были специфическими интеракторами при вытягивании PIB.
Можно было бы провести глобальный анализ протеомики и сравнить результаты с анализом PIB, чтобы определить, определяется ли состав PPPome численностью PPP или регулируется посттрансляционными механизмами. PIB-MS является широко применимым инструментом, который позволил нам выявить различия в паттернах экспрессии ППС в различных условиях, таких как межфазные и митотические образцы или различия между линиями раковых клеток.
