هذا يوفر نتائج عالية الجودة لعملية التمثيل الغذائي للفوسفات الإينوزيتول في جميع الكائنات الحية التي اختبرناها حتى الآن. كما سيوفر نظرة ثاقبة على مسار التخليق الحيوي الخلوي الجديد الذي ندركه حاليا. تحليل استقلاب فوسفات الإينوزيتول بواسطة CE-ESI-MS أسرع, حساسة للغاية, وقادرة على توفير معلومات هيكل لجمعيات فوسفات الإينوزيتول.
للبدء ، قم بإعداد مطياف كتلة التأين الكهربائي بالرحلان الكهربائي الشعري أو نظام CE-ESI-MS الذي يتكون من نظام CE تجاري ، ومطياف كتلة ترادفي رباعي ثلاثي الأقطاب ، مجهز بمصدر Agilent Jet Stream ESI. بعد ذلك ، قم بتوصيل مقسم تدفق الغمد 1: 100 ومخرج مضخة كروماتوغرافيا السائل المتساوي ، وتأكد من أن قارورة مدخل نظام CE في نفس ارتفاع طرف البخاخ لمحلل الكتلة. بعد ذلك ، استخدم إصدار MassHunter Workstation أو برنامج MS مشابه ، للتحكم في النظام بأكمله والحصول على البيانات وتحليلها.
بعد تحضير المخزن المؤقت للتشغيل CE وسائل الغمد ، قم بتثبيت سائل الغمد عن طريق التطهير بمعدل خمسة ملليلتر في الدقيقة لمدة خمس دقائق. ثم اضبط معدل التدفق على ملليلتر واحد في الدقيقة وضغط المضخة على 180 بار. تأكد من أن الأنبوب المعاد تدويره يتصل مرة أخرى بزجاجة السائل الغمد لإعادة استخدام المذيب.
بعد ذلك ، باستخدام قاطع عمود شعري بشفرة ماسية دوارة ، قم بقص طرفي الشعيرات الدموية CE-MS بشكل صحيح مع نافذة للكشف عن الأشعة فوق البنفسجية. ثم قم بإزالة اثنين إلى ثلاثة سنتيمترات من طلاء البوليميد على كلا الطرفين بأخف وزنا ، ونظف السطح الشعري باستخدام الأيزوبروبانول. لتثبيت الشعيرات الدموية ، قم بمطابقة الشعيرات الدموية في شريط CE-MS.
ثم انقر فوق الزر "تغيير الكاسيت" وقم بتثبيت الكاسيت في جهاز CE. لتنشيط الشعيرات الدموية ، اغسل الشعيرات الدموية أولا بهيدروكسيد صوديوم مولاري واحد ، متبوعا بالماء لمدة 10 دقائق ، ثم تشغيل CE لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، أدخل الشعيرات الدموية في بخاخ CE-MS.
باستخدام عدسة مكبرة وبرغي الضبط في البخاخ ، اضبط مخرج الشعيرات الدموية بدقة ، مما يضمن أن الطرف الشعري يبرز حوالي 0.1 ملم من طرف البخاخ. تحقق من ثبات بخاخ ESI في وضع المسح الكامل. يجب أن يكون تذبذب إجمالي الكهربية الأيونية في حدود 5٪ثم ، قم بإجراء اختبار تشغيل مع معايير فوسفات الإينوزيتول.
بعد تحضير خليط المعايير الداخلية ، امزج 10 ميكرولتر من العينة مع 0.5 ميكرولتر من خليط المعايير الداخلية وقارورة عينة CE. عند استخدام نظام التجديد ، انقر فوق الزر "تغيير الزجاجة". ضع 250 ملليلتر من المخزن المؤقت المعد CE في زجاجة المنحل بالكهرباء.
ثم انقر فوق Clean Tubes مع الاحتفاظ بإبرة التجديد في قنينة ماء. اضبط معلمات ESI و MS. ثم قم بتحسين معلمات المصدر باستخدام محسن المصدر مع مزيج من معايير الإينوزيتول متعدد الفوسفات ، وإعدادات مراقبة التفاعل المتعددة باستخدام MassHunter Optimizer مع جميع المعايير.
بعد ذلك ، قم بإجراء تشغيل لمستخلصات فوسفات الإينوزيتول وتحقق من النتائج. قم بتعيين تسلسل عندما يكون هناك المزيد من العينات. بعد القياس ، دع MS في وضع الاستعداد ولا تقم بإيقاف تشغيل مضخة الكروماتوغرافيا السائلة.
استبدل بخاخ CE-ESI-MS ببخاخ LC-ESI-MS في حالة عدم وجود مصدر سائل غمد. لتحليل البيانات ، افتح برنامج التحليل الكمي وقم بإنشاء دفعة لجميع العينات. بعد ذلك ، قم بإنشاء طريقة جديدة من بيانات مراقبة التفاعل المتعدد المكتسبة ، وقم بتعيين فوسفات الإينوزيتول الكربون-13 كمعايير داخلية.
بعد ذلك ، تحقق من مركب مراقبة التفاعل المتعدد ، ووقت الاحتفاظ ، والمعايير الداخلية ، وإعداد التركيز والتأهيل. قم بتمرير التحقق من الصحة والخروج لتطبيق الطريقة على الدفعة الحالية. احفظ الطريقة.
ثم تحقق مما إذا كانت كل قمة في الدفعة مدمجة بشكل صحيح. خلاف ذلك ، دمج الذروة يدويا. تصدير النتائج في جدول بيانات, وتحديد كمية بيروفوسفات الإينوزيتول, من خلال مقارنة استجابة ذروة anolyte مع استجابة الذروة المعنية من النظير المستقر المسمى المعايير الداخلية مع تركيزات معروفة.
أخيرا ، مع التركيز المقاس في فوسفات الإينوزيتول ، واستخراج المحلول وحجمه ، وحساب الكميات المطلقة وزيادة تطبيع الكمية حسب عدد الخلايا أو محتوى البروتين. احسب التركيز الخلوي بناء على عدد الخلايا ومتوسط حجم الخلية لخلايا HCT116. يتم عرض الكهربية الأيونية المستخرجة لمعايير إينوزيتول بيروفوسفات بتركيز اثنين من الميكرومول هنا.
يتم إدراج التمثيل الغذائي للإينوزيتول بيروفوسفات في الثدييات مع هياكلها المبسطة. يظهر هنا تشغيل CE-ESI-MS لخلايا HCT116 من كلية لندن الجامعية أو UCL. تم استخدام CE-MS لتحديد التباين في مستويات IP8 بين خلايا HCT116 من UCL وتلك الموجودة في المعاهد الوطنية للصحة.
تحتوي خلايا HCT116 من UCL على مستويات أعلى بسبعة أضعاف من IP8 من تلك الموجودة في المعاهد الوطنية للصحة. يوازي التراكم الكبير ل 1،5-IP8 في خلايا HCT116 UCL زيادة كبيرة في 1-IP7. أظهر تحليل CE-ESI-MS لخلايا HCT116 المعالجة بفلوريد الصوديوم من المعاهد الوطنية للصحة ارتفاعا قدره 5-IP7 ، إلى جانب انخفاض في IP6 وظهور 5-PPIP4.
على الرغم من انخفاض مستويات 1-IP7 إلى حد ما ، إلا أنها ليست غائبة تماما في الخلايا المعالجة بفلوريد الصوديوم ، ولكن في الغالب تحت حدود الكشف. من المهم تشكيل درجة CE-ESI-MS مستقرة. نوصي بالتحقق من قابلية وحساسية النظام قبل القياسات.
هذه التقنية تسمح لتوفير التمثيل الغذائي اينوزيتول الفوسفات, يزرع والأنسجة, وأيضا توفير فرصة لدراسة عن كثب بيوزيتول بيروفوسفات ذات الصلة بيولوجيا.
