Выделение эндотелиальной и интерстициальной клеток первичного клапана человека имеет решающее значение для понимания основного механизма патогенеза заболевания кальцификального аортального клапана. Когда клапан иссекается из нативной ткани, жизнеспособность клетки падает. Итак, мы определили метод, который продлевает жизнеспособность клеток.
После получения извлеченных образцов ткани клапана извлекают корень аорты и погружают ткань в коническую трубку объемом 50 миллилитров, содержащую стерильный раствор для полоскания. После 10-минутной инкубации в ведре со льдом на коромысле распылите в трубки 70% этанола. В стерильной культуральной вытяжке перенесите ткань в чашку Петри и иссейте два клапанных листочка.
Поместите одну листовку в криогенный флакон и заморозьте ткань в жидком азоте для хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Чтобы зафиксировать ткань для окрашивания содержания кальция, разрежьте второй листок пополам от узелка до шарнира и поместите оба кусочка ткани в кассету, которая погружена в 4% параформальдегид. Затем поместите всю установку на коромысло при комнатной температуре минимум на два, но не более четырех часов.
Чтобы изолировать интерстициальные ячейки клапана, перенесите листок в новую 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую ледяной PBS, и поместите трубку на коромысло в течение двух минут при комнатной температуре. После перемешивания переложите ткань в 60-миллиметровую посуду, содержащую пять-семь миллилитров холодного раствора коллагеназы. Используйте щипцы, чтобы окунуть обе стороны листочка три-четыре раза в раствор перед инкубацией ткани в инкубаторе клеточной культуры в течение пяти-10 минут при 37 градусах Цельсия с мягким раскачиванием ткани три-четыре раза каждые две минуты.
В конце инкубации переложите два миллилитра раствора из чашки в стерильную коническую трубку объемом 15 миллилитров. Поместив щипцы в узелок листка, используйте стерильный ватный тампон, чтобы провести ткань от щипцов к шарниру, одновременно закручивая тампон вдоль листка. После смазывания промойте тампон в тюбике раствора коллагеназы и смахните другую сторону ткани, как только что было продемонстрировано.
После полоскания повторите тампон с обеих сторон ткани и используйте один миллилитр пипетки и раствор коллагеназы, чтобы смыть любые вытеснительные клетки с обеих сторон поверхности листочка в блюдо. После полоскания переложите весь раствор из чашки в трубку, содержащую клетки из тампона, и поместите оставшуюся ткань клапана в новую 15-миллилитровую коническую трубку, содержащую семь миллилитров стерильного раствора коллагеназы. Гранулируют изолированный клапан эндотелиальных клеток путем центрифугирования и повторно суспендируют клеточную гранулу в трех миллилитрах сосудистой эндотелиальной клеточной питательной среды.
После второй центрифугирования повторно суспендируют клетки в одном миллилитре свежей питательной среды для подсчета и посеяли клетки с концентрацией от 5 х 10 до пятой клеток на квадратный сантиметр в покрытых коллагеном шестилуночных пластинах, обновляя среду каждые три-четыре дня. Когда пластыри эндотелиальных клеток клапана покрывают более 80% пластины, разделите клетки с концентрацией от 1,3 х 10 до четвертой клетки на квадратный сантиметр, в зависимости от скорости их роста. После того, как клетки были расширены, подтвердите фенотип их эндотелиальных клеток клапана иммунофлуоресцентным окрашиванием для маркеров эндотелиальных клеток клапана, представляющих интерес.
Чтобы изолировать интерстициальные клетки клапана, поместите трубку, содержащую мазок к ткани листочка, в инкубатор клеточной культуры на 12-18 часов со слегка открытой крышкой. В конце инкубации используйте серологическую пипетку, чтобы мягко диссоциировать ткань, чтобы обеспечить высвобождение интерстициальных клеток клапана и фильтровать клеточную суспензию через 70-микронный ситечко в коническую трубку объемом 50 миллилитров. Добавьте семь миллилитров интерстициальной клеточной среды клапана в трубку и соберите клетки путем центрифугирования.
Повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре свежей клапанной интерстициальной среды для роста клеток для подсчета и посева клеток в концентрации 1,3 х 10 четвертых клеток на квадратный сантиметр в чашке диаметром 60 миллиметров. Через один-два дня промыть культуры два раза PBS и добавить в клетки свежую среду. Когда клетки достигнут 90%-ной конфлюции, промыть культуры два раза DPBS и обработать клетки двумя-тремя миллилитрами предварительно подогретого диссоциационного реагента в течение двух-трех минут при 37 градусах Цельсия.
Когда клетки отсоединятся, переместите клеточную суспензию в коническую трубку для центрифугирования и осторожно повторно суспендируйте гранулу в трех-четырех миллилитрах предварительно нагретой межстициальной среды роста клеток клапана для подсчета. Затем засейте клетки в соотношении один к двум к исходной плотности культуры и оцените фенотип роста интерстициальных клеток клапана путем иммунофлуоресцентного окрашивания, как показано на рисунке. Образцы тканей кальцифицированного заболевания аортального клапана демонстрируют измененную морфологию с тяжелыми узелками кальцификации по сравнению с контрольными некальцифицированными образцами тканей.
Когда кальцификация оценивается окрашиванием фон Косса, в пораженной ткани листочка наблюдается темно-коричневое или черное осаждение. Раствор для холодного хранения значительно стабилизирует иссеченные клетки ткани клапана с примерно 40%-ной жизнеспособностью, наблюдаемой для обоих типов восстановленных клеток в течение 61 часа после экстракции клапана. Морфологический анализ эндотелиальных клеток клапана выявляет упакованные булыжно-подобные ингибированные клетки контакта роста, в то время как интерстициальные клетки клапана демонстрируют морфологию веретена, аналогичную той, которая наблюдается для миофибробластов.
Иммуноокрашивание подтверждает, что большинство расширенных эндотелиальных и клапанных интерстициальных клеток экспрессируют ожидаемые тканеспецифические маркеры. Помните, что мягкое, но твердое смазывание листочка имеет решающее значение для высвобождения слоя эндотелиальных клеток, и что для высвобождения интерстициальной клеточной популяции изнутри плотной ткани требуется ночная инкубация с коллагеназой. После того, как клеточные линии были установлены, они могут быть использованы для механического исследования в отношении патогенеза конкретного заболевания аортального клапана, включая начало заболевания, прогрессирование и лечение.
