O isolamento da célula endotelial e intersticial da válvula primária humana é fundamental para a compreensão do mecanismo subjacente da patogênese da doença valvar aórtica calcificada. Quando a válvula é excisada do tecido nativo, a viabilidade celular cai. Então, identificamos um método que prolonga a viabilidade celular.
Depois de receber as amostras de tecido valvar extraídas, extraia a raiz da aorta e submerja o tecido em um tubo cônico de 50 mililitros contendo solução de enxágue estéril. Após uma incubação de 10 minutos em um balde de gelo em um balancim, pulverize os tubos com etanol a 70%. Em um capuz de cultura de tecidos estéreis, transfira o tecido para uma placa de Petri e expiregue dois folhetos valvares.
Coloque um folheto em um frasco criogênico e congele o tecido em nitrogênio líquido para armazenamento de menos 80 graus Celsius. Para fixar o tecido para coloração do conteúdo de cálcio, corte o segundo folheto ao meio do nódulo à dobradiça e coloque ambos os pedaços de tecido em um que esteja submerso em 4% de paraformaldeído. Em seguida, coloque toda a configuração no balancim à temperatura ambiente por um período mínimo de duas, mas não mais de quatro horas.
Para isolar as células intersticiais da válvula, transfira o folheto para um novo tubo cônico de 50 mililitros contendo PBS gelado e coloque o tubo em um balancim por dois minutos à temperatura ambiente. Após a mistura, transfira o tecido para um prato de 60 milímetros contendo cinco a sete mililitros de solução fria de colagenase. Use fórceps para mergulhar ambos os lados do folheto três a quatro vezes na solução antes de incubar o tecido na incubadora de cultura de células por cinco a 10 minutos a 37 graus Celsius com balanço suave do tecido três a quatro vezes a cada dois minutos.
No final da incubação, transfira dois mililitros de solução do prato para um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Colocando fórceps no nódulo do folheto, use um cotonete estéril para deslizar o tecido do fórceps para a dobradiça enquanto gira o cotonete ao longo do folheto. Depois de passar o dedo, lave o cotonete no tubo de solução de colagenase e esfregue o outro lado do tecido, como acabou de demonstrar.
Após o enxágue, repita o cotonete em ambos os lados do tecido e use uma pipeta de um mililitro e uma solução de colagenase para enxaguar quaisquer células desalojadas de ambos os lados da superfície do folheto no prato. Após o enxágue, transfira toda a solução do prato para o tubo que contém as células do cotonete e coloque o tecido valvar restante em um novo tubo cônico de 15 mililitros contendo sete mililitros de solução estéril de colagenase. Pellet as células endoteliais valvares isoladas por centrifugação e ressuspender o pellet celular em três mililitros de meio de crescimento de células endoteliais vasculares.
Após uma segunda centrifugação, ressuspender as células em um mililitro de meio de crescimento fresco para contagem e semear as células a uma concentração de 5 x 10 a quinta células por centímetro quadrado em placas de seis poços revestidas de colágeno, refrescando o meio a cada três a quatro dias. Quando os adesivos de células endoteliais da válvula cobrirem mais de 80% da placa, divida as células em uma concentração de 1,3 x 10 para a quarta célula por centímetro quadrado, dependendo de sua taxa de crescimento. Uma vez que as células tenham sido expandidas, confirme seu fenótipo de células endoteliais valvares por coloração imunofluorescente para marcadores de células endoteliais valvares de interesse.
Para isolar as células intersticiais da válvula, coloque o tubo contendo o tecido de swab para folheto na incubadora de cultura celular por 12 a 18 horas com a tampa ligeiramente aberta. No final da incubação, use uma pipeta sorológica para dissociar suavemente o tecido para garantir a liberação das células intersticiais da válvula e filtrar a suspensão celular através de um filtro de 70 mícrons em um tubo cônico de 50 mililitros. Adicione sete mililitros de meio de célula intersticial valvar ao tubo e colete as células por centrifugação.
Ressuspeite o pellet em um mililitro de meio de crescimento celular intersticial valvar fresco para contagem e semeie as células a uma concentração de 1,3 x 10 das quartas células por centímetro quadrado em um prato tratado com cultura de tecido de 60 milímetros de diâmetro. Após um a dois dias, lave as culturas duas vezes com PBS e adicione meio fresco às células. Quando as células atingirem uma confluência de 90%, lave as culturas duas vezes com DPBS e trate as células com dois a três mililitros de reagente de dissociação pré-aquecido por dois a três minutos a 37 graus Celsius.
Quando as células se desprenderem, transfira a suspensão celular para um tubo cônico para centrifugação e ressuscite suavemente o pellet em três a quatro mililitros de meio de crescimento celular intersticial valvar pré-aquecido para contagem. Em seguida, semear as células em uma proporção de um para dois para a densidade de cultura original e avaliar o fenótipo de crescimento celular intersticial valvar por coloração imunofluorescente, conforme demonstrado. As amostras de tecido da valvopatia aórtica calcifica exibem uma morfologia alterada com nódulos pesados de calcificação em comparação com amostras de tecido não calcificado de controle.
Quando a calcificação é avaliada pela coloração de Von Kossa, observa-se precipitação marrom escura ou preta no tecido do folheto doente. A solução de armazenamento a frio estabiliza grandemente as células de tecido valvar excisadas com uma viabilidade de aproximadamente 40% observada para ambos os tipos de células recuperadas até 61 horas após a extração da válvula. A análise morfológica das células endoteliais da válvula revela células inibidas de contato de crescimento semelhantes a paralelepípedos compactados, enquanto as células intersticiais da válvula demonstram uma morfologia em forma de fuso semelhante à observada para miofibroblastos.
A imunocoloração confirma que a maioria das células endoteliais e intersticiais valvares expandidas expressa os marcadores específicos teciduais esperados. Lembre-se de que o esfregaço suave, mas firme, do folheto é fundamental para a liberação da camada de células endoteliais e que a incubação noturna com colagenase é necessária para a liberação da população de células intersticiais de dentro do tecido denso. Uma vez que as linhagens celulares tenham sido estabelecidas, elas podem ser usadas para estudo mecânico sobre patogênese específica da doença valvar aórtica, incluindo o início, a progressão e o tratamento da doença.
