L’isolement de la cellule endothéliale et interstitielle valvulaire primaire humaine est essentiel pour comprendre le mécanisme sous-jacent de la pathogenèse de la valvulopathie aortique calcifiée. Lorsque la valve est excisée du tissu natif, la viabilité cellulaire diminue. Nous avons donc identifié une méthode qui prolonge la viabilité cellulaire.
Après avoir reçu les échantillons de tissu valvulaire extraits, extraire la racine aortique et immerger le tissu dans un tube conique de 50 millilitres contenant une solution de rinçage stérile. Après une incubation de 10 minutes dans un seau à glace sur une bascule, vaporiser les tubes avec de l’éthanol à 70%. Dans une hotte de culture tissulaire stérile, transférer le tissu dans une boîte de Petri et exciser deux feuillets de valve.
Placez une notice dans un flacon cryogénique et congelez le tissu dans de l’azote liquide pour un stockage de moins 80 degrés Celsius. Pour fixer le tissu pour la coloration de la teneur en calcium, couper le deuxième feuillet en deux du nodule à la charnière et placer les deux morceaux de tissu dans une cassette qui est immergée dans 4% de paraformaldéhyde. Ensuite, placez toute la configuration sur la bascule à température ambiante pendant au moins deux heures mais pas plus de quatre heures.
Pour isoler les cellules interstitielles valvulaires, transférer le feuillet dans un nouveau tube conique de 50 millilitres contenant du PBS glacé et placer le tube sur une bascule pendant deux minutes à température ambiante. Après mélange, transférer le tissu dans un plat de 60 millimètres contenant cinq à sept millilitres de solution froide de collagénase. Utilisez une pince pour tremper les deux côtés de la notice trois à quatre fois dans la solution avant d’incuber le tissu dans l’incubateur de culture cellulaire pendant cinq à 10 minutes à 37 degrés Celsius avec un léger balancement du tissu trois à quatre fois toutes les deux minutes.
À la fin de l’incubation, transférer deux millilitres de solution de la capsule dans un tube conique stérile de 15 millilitres. En plaçant une pince sur le nodule de la notice, utilisez un coton-tige stérile pour faire glisser le tissu de la pince à la charnière tout en faisant tourner l’écouvillon le long de la notice. Après avoir glissé, rincer l’écouvillon dans le tube de solution de collagénase et frotter l’autre côté du tissu comme cela vient d’être démontré.
Après le rinçage, répétez l’écouvillonnage des deux côtés du tissu et utilisez une pipette d’un millilitre et une solution de collagénase pour rincer les cellules délogées des deux côtés de la surface de la notice dans le plat. Après le rinçage, transférer toute la solution de la capsule dans le tube contenant les cellules de l’écouvillon et placer le tissu valvulaire restant dans un nouveau tube conique de 15 millilitres contenant sept millilitres de solution de collagénase stérile. Enduit les cellules endothéliales valvulaires isolées par centrifugation et remet en suspension la pastille cellulaire dans trois millilitres de milieu de croissance des cellules endothéliales vasculaires.
Après une deuxième centrifugation, remettre les cellules en suspension dans un millilitre de milieu de croissance frais pour compter et ensemencer les cellules à une concentration de 5 x 10 à la cinquième cellule par centimètre carré dans des plaques à six puits recouvertes de collagène, rafraîchissant le milieu tous les trois à quatre jours. Lorsque les patchs de cellules endothéliales valvulaires couvrent plus de 80% de la plaque, diviser les cellules à une concentration de 1,3 x 10 à la quatrième cellule par centimètre carré, en fonction de leur taux de croissance. Une fois que les cellules ont été dilatées, confirmer leur phénotype de cellule endothéliale valvulaire par coloration immunofluorescente pour les marqueurs de cellules endothéliales valvulaires d’intérêt.
Pour isoler les cellules interstitielles valvulaires, placez le tube contenant l’écouvillon pour feuilleter le tissu dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 12 à 18 heures avec le bouchon légèrement ouvert. À la fin de l’incubation, utilisez une pipette sérologique pour dissocier délicatement le tissu afin d’assurer la libération des cellules interstitielles valvulaires et filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine de 70 microns dans un tube conique de 50 millilitres. Ajouter sept millilitres de milieu cellulaire interstitiel valvulaire au tube et recueillir les cellules par centrifugation.
Remettez en suspension la pastille dans un millilitre de milieu de croissance interstitiel de valve fraîche pour compter et ensemencer les cellules à une concentration de 1,3 x 10 des quatrièmes cellules par centimètre carré dans une boîte traitée par culture tissulaire de 60 millimètres de diamètre. Après un à deux jours, laver les cultures deux fois avec du PBS et ajouter un milieu frais aux cellules. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 90%, laver les cultures deux fois avec DPBS et traiter les cellules avec deux à trois millilitres de réactif de dissociation préchauffé pendant deux à trois minutes à 37 degrés Celsius.
Lorsque les cellules se sont détachées, transférer la suspension cellulaire dans un tube conique pour la centrifugation et remettre doucement la pastille en suspension dans trois à quatre millilitres de milieu de croissance interstitiel de cellules valvulaires préchauffées pour le comptage. Ensuite, ensemencez les cellules à un rapport de un à deux par rapport à la densité de culture d’origine et évaluez le phénotype de croissance cellulaire interstitielle valvulaire par coloration immunofluorescente comme démontré. Les échantillons de tissus de la valvulopathie aortique calcifiée présentent une morphologie altérée avec de lourds nodules de calcification par rapport aux échantillons de tissus témoins non calcifiés.
Lorsque la calcification est évaluée par coloration de Von Kossa, une précipitation brun foncé ou noire est observée dans le tissu foliaire malade. La solution de stockage frigorifique stabilise considérablement les cellules du tissu valvulaire excisé avec une viabilité d’environ 40% observée pour les deux types de cellules récupérées jusqu’à 61 heures après l’extraction valvulaire. L’analyse morphologique des cellules endothéliales valvulaires révèle des cellules inhibées par contact de croissance en forme de pavé emballé, tandis que les cellules interstitielles valvulaires présentent une morphologie fusiforme similaire à celle observée pour les myofibroblastes.
L’immunomarquage confirme que la majorité des cellules endothéliales valvulaires expansées et interstitielles valvulaires expriment les marqueurs tissulaires spécifiques attendus. Rappelez-vous qu’un écouvillonnage doux mais ferme de la foliole est essentiel pour la libération de la couche de cellules endothéliales et que l’incubation nocturne avec la collagénase est nécessaire pour la libération de la population de cellules interstitielles de l’intérieur du tissu dense. Une fois que les lignées cellulaires ont été établies, elles peuvent être utilisées pour l’étude mécanique concernant la pathogenèse spécifique de la maladie valvulaire aortique, y compris l’apparition, la progression et le traitement de la maladie.
