A manutenção da viabilidade potencial oócida após o armazenamento a longo prazo representa uma ferramenta de grande oportunidade, pois melhoraria a reprodução animal doméstica por meio de programas de seleção genética, contribuiria para preservar a biodiversidade através da conservação de espécies de animais selvagens e aumentaria a pesquisa em biotecnologia. A vitrificação de oócitos juvenis foi muito menor no intervalo de geração em programas de reprodução. A vitrifação pelo resfriamento e aquecimento de ultraarrapidas é considerada uma abordagem padrão na preservação do oócito do gado.
No entanto, em ovelhas este procedimento ainda é considerado relativamente novo e falta um método padrão. Neste vídeo, descrevemos um protocolo para vitrificação de oócito de ovelha, coletado de doadores juvenis e adultos, e in vitro amadurecido antes da criopreservação. O protocolo inclui todos os procedimentos desde a maturação in vitro, vitrificação, aquecimento e cultura pós-aquecimento.
Após a recuperação do complexo de oócitos cumulus, onde amadureceu in vitro por 24 horas em estática uma condição que inclui para oócito juvenil, a suplementação com cem micromolar de trehalose em meio de maturação. Após a maturação in vitro, os oócitos foram desnudados de células Cumulus mecanicamente por tubos suavemente e examinados sob microscópio estéreo, com ampliação de 60x. A seleção dos oócitos para apresentar nos procedimentos de vitrificação representa o primeiro passo importante para garantir a aplicação bem sucedida deste procedimento.
Somente aqueles com o citoplasma uniforme, com distribuição homogênea de gotículas lipídicas, integridade de toda Emma larga e contínua pivô no espaço, zona compacta pellucida o diâmetro externo de cerca de 19 micrômetros e mostrando a extrusão do primeiro corpo polar, e assim no M2, o estágio deve ser selecionado. A vitrificação foi realizada utilizando-se o método de volume essencial mínimo, com um dispositivo Cryotops. Após a seleção, um grupo de cinco oócitos juvenis foram condicionados a 38,5 graus Celsius em média base por dois minutos.
Os oócitos foram então desidratados por três minutos de exposição a uma solução de calibração. O carregamento do oócito no dispositivo de vitrificação utilizado é um passo importante e crítico. O criotop usa uma tira de polipropileno presa a um suporte.
Neste método, os oócitos na solução de vitrificação, menos de 0 ponto mililitro são rapidamente carregados com um capilar de vidro em cima da tira de filme. Em seguida, a solução deve ser removida, deixando para trás uma camada fina o suficiente para cobrir as células a serem criopreservadas. Antes de ser carregado no dispositivo Cryotop e diretamente mergulhado em nitrogênio líquido dentro de 30 segundos.
Para temperatura biológica interior quente, o conteúdo de cada dispositivo de vitrificação foi transferido do nitrogênio líquido para 200 gotas de microliter de solução de trehalose decrescente. Os oócitos foram transferidos o conjunto foi, arrastando os oócitos com uma pipeta fina e de vidro, para promover a remoção de crioprotetores intracelulares. Finalmente, os oócitos foram pré-criados em um meio base em incubadora em 5% de dióxido de carbono.
Imediatamente após o aquecimento, e para cada ponto de tempo da cultura pós-aquecimento, os oócitos foram avaliados morfologicamente usando um microscópio invertido com ampliação de 100x. A tolerância criogenada de oócitos de doadores juvenis é menor em comparação com as alteradas com menor integridade da membrana após o aquecimento. O uso de trehalose no meio de maturação induzido em oócitos juvenis maior integridade da membrana, aumentando as taxas de sobrevivência após a vitrificação.
No entanto, as taxas de decote, fertilização e desenvolvimento de oócitos juvenis não foram aumentadas pela suplementação de trehalose. O uso de mídia com concentração de cálcio igual a 2,2 miligramas de dizlitos para a vitrificação de oócitos juvenis, deve maiores taxas de fertilização em comparação com oócitos vitrificados com concentração de cálcio, mas não foram encontradas diferenças que permitam a produção. Comparando a cultura pós-aquecimento em diferentes durações, mostramos que após quatro horas de oócito cultural coletado de dois mais velhos são capazes de recuperar as ligações energéticas e a configuração microtubular, e restaurar a competência de desenvolvimento com maior desperdício de decotes e blastócitos.
A atividade mitocondrial foi maior em oócitos juvenis vitrificados após quatro horas de cultura pós-aquecimento, em comparação com outros pontos de tempo. A parting de distribuição mitocondrial também mudou durante seis horas de cultura pós-aquecimento. Além disso, os níveis intracelulares de espécies de oxigênio reativas foram significativamente menores em oócitos juvenis em duas horas de cultura pós-aquecimento em comparação com 0, 4 e 6 horas.
No entanto, e em contraste com o encontrado em outros oócitos, as taxas de ativação partenogentica espontânea aumentaram durante a cultura pós-aquecimento em oócitos juvenis. Uma das principais vantagens do método proposto é que ele inclui todas as etapas desde a coleta de oócito até a maturação in vitro, vitrificação e aquecimento. Além disso, inclui um período de cultura pós-aquecimento para permitir a recuperação de oócitos dos danos incorridos durante o procedimento de vitrificação.
Escolher o momento ideal para fertilização é desafiador, podendo impactar no resultado do programa de vitrificação. Deve-se considerar também que, ao contrário do congelamento lento, a vitrificação é uma técnica manual e, portanto, é dependente do operador. Por essa razão, um grande desafio é a necessidade de técnicos e pesquisadores qualificados que levem em consideração o efeito operador na avaliação do resultado do programa de vitrificação.
Outros estudos do nosso laboratório permitirão a tentativa de padronizar o procedimento de vitrificação e seleção de oócitos, e em melhor composição da mídia para as necessidades do oócito juvenil. Um desrespeito ao uso da cultura e do caráter e antioxidante oferecemos oportunidades promissoras.
