Этот протокол имеет много преимуществ по сравнению с используемой в настоящее время метаболомикой дрожжей, поскольку он обладает высокой специфичностью, высокой чувствительностью, а также может профилирования многих различных классов метаболитов, включая изомерные, изобарические, гидрофильные и гидрофобные молекулы. Метод гашения, используемый в этом протоколе, останавливает все ферментативные реакции, значительно уменьшая утечку метаболитов из клеток. Библиотека MS1, встроенная в этот протокол, взята из различных запусков MS2.
После ночной культивировании при 30 градусах Цельсия и 200 оборотах в минуту определяют количество дрожжевых клеток на миллилитр культуры и добавляют пять миллилитров стерилизованного 20%-го раствора глюкозы в каждую из двух колб Эрленмейера, содержащих 45 миллилитров автоклавной среды YP на колбу. Используйте стерильную трансферную пипетку, чтобы добавить пять раз по 10 к седьмым дрожжевым клеткам в каждую колбу и выращивать дрожжевые клетки в течение как минимум 24 дополнительных часов при 30 градусах Цельсия при 200 оборотах в минуту. Для экстракции метаболитов после культивирования соберите дрожжевые клетки методом центрифугирования и быстро удалите супернатант.
Поместите трубку на сухой лед и добавьте два миллилитра минус 20 градусов цельсия хлороформа, один миллилитр минус 20 градусов Цельсия метанола, один миллилитр ледяной нано чистой воды и 200 микролитров стеклянных шариков от 425 до 600 микрон кислоты, вымытых в ячейки. Когда шарики будут добавлены, поместите трубку, покрытую алюминиевой фольгой, в комплект держателей пенопластовых трубок с фиксатором и вихрьте образец в течение 30 минут на средней скорости при четырех градусах Цельсия, чтобы облегчить извлечение метаболита. Затем инкубируют трубку в течение 15 минут на льду перед центрифугированием образца, чтобы обеспечить отделение верхней водной фазы от среднего мусора и белка и нижних органических фаз.
Используйте микропипетку для переноса примерно 400 микролитров верхней водной фазы в промытую и меченую 1,5-миллилитровую трубку, содержащую 800 микролитров минус 20 градусов Цельсия ацетонитрила. Затем центрифугируют образец и переносят 800 микролитров верхней части супернатанта в меченый масс-спектрометрический флакон для хранения в нулевой степени до жидкой хроматографии тандемного масс-спектрометрического анализа. Чтобы отделить извлеченные метаболиты, ультразвуком обжаривают пробный флакон в течение 15 минут, а затем три 10-секундных вихря при комнатной температуре.
После вихря поместите флакон в пластину скважины жидкого хроматографа и установите столбик на 45 градусов Цельсия со скоростью потока 0,25 миллилитра в минуту и плитой скважины до нуля градусов Цельсия. Затем используйте таблицу, чтобы установить градиенты жидкостной хроматографии для анализа. После разделения используют 10 микролитровых объемов образца инъекции как в положительном, так и в отрицательном режимах электрораспроливной ионизации в масс-спектрометре, оснащенном нагретой электрораспролитной ионизацией, для идентификации и количественной оценки водорастворимых метаболитов.
В конце анализа откройте необработанные данные в соответствующей программе для анализа соединений и используйте библиотеку масс-спектральной фрагментации для сопоставления масс-спектров для аннотирования метаболитов, идентифицированных в анализе. Точные массы MS1 и изотопных паттернов также могут быть идентифицированы, чтобы можно было аннотировать метаболиты с использованием онлайн-баз данных. Затем используйте библиотеку баз данных и спектров для поиска ms2 спектров необработанных данных.
На следующий день, после гашения дрожжевых клеток, тщательно промыть клетки 15 миллилитрами буфера ABC и собрать клетки центрифугированием. Повторно суспендируют гранулу в одном миллилитрах свежего буфера ABC и добавляют 500 микролитров раствора йодида пропидия в клетки. Вихрь образца три раза в течение 10 секунд на вихрь и инкубировать клетки в течение 10 минут на льду, защищенном от света.
В конце инкубации соберите клетки центрифугированием и промывайте клетки три раза одним миллилитром свежего буфера ABC за промывку. После последней промывки повторно суспендируют гранулу в 300 микролитрах свежего буфера ABC и добавьте 10 микролитров полученной клеточной суспензии на слайд микроскопа. Используйте флуоресцентный микроскоп для захвата дифференциального интерференционного контраста и флуоресцентной микроскопии изображений клеток с фильтрами, установленными на длину волны возбуждения 593 нанометра и длину волны излучения 636 нанометров.
Затем используйте соответствующую программу анализа изображений, чтобы подсчитать общее количество клеток в изображениях яркого поля и флуоресценции, а также определить интенсивность флуоресценции окрашивания для отдельных клеток. Модифицированный метод закалки клеток вызывает значительно меньшее повреждение плазматической мембраны и клеточной стенки, чем небуферизованный 80%-ный метанол при минус 40 градусах Цельсия методом закалки. Действительно, почти все клетки, подвергаемые закалке с помощью модифицированного метода, демонстрируют красную флуоресцентную эмиссию, которая характерна для дрожжевых клеток, в которых плазматическая мембрана и клеточная стенка не повреждены.
Напротив, почти все клетки, подвергавшиеся закалке с использованием небуферированного 80%-ного метанола при 40 градусах Цельсия методом, демонстрировали зеленое флуоресцентное излучение, что характерно для дрожжевых клеток, в которых плазматическая мембрана и клеточная стенка значительно повреждены. Модифицированный метод закалки клеток также вызывает значительно меньшую утечку водорастворимых метаболитов из дрожжевых клеток, чем небуферизованный 80%-ный метанол при минус 40 градусах Цельсия методом закалки. Значения сдвига времени удержания водорастворимых стандартов метаболитов значительно ниже, а пиковые формы значительно острее для цвиттерионной фазовой колонны по сравнению с колонкой обратной фазы.
Еще одним преимуществом метода тандемной масс-спектрометрии жидкостной хроматографии является возможность использования цвиттерионной фазовой колонки для эффективного разделения различных водорастворимых метаболитов с различными структурными, физическими и химическими свойствами. Обязательно сделайте йодид пропидия, стоящий в темноте, а также убедитесь, что вы собрали верхнюю фазу, не нарушая среднюю фазу. Если какой-либо MSP не может быть аннотирован из-за отсутствия спектральной библиотеки MS2, то используйте ЯМР для иллюстрации этой структуры.
