Этот метод использует инструменты, обычно встречающиеся в большинстве лабораторных сред, и позволяет анализировать несколько образцов одновременно. Этот метод может дать ключевое представление о том, как ферменты липидного обмена регулируются в клеточном контексте и в различных генетических фонах. Инокулируют колонию из пластины для культивации дрожжей в 20 миллилитров среды SC, содержащей 2% декстрозы, и инкубируют при 30 градусах Цельсия в течение ночи с встряхиванием при 200 об/мин.
На следующий день разводят культуру в 50 миллилитрах свежей среды до конечного ОД 0,2 и выращивают его в течение 24 часов до достижения стационарной фазы. Подготовьте для каждого образца две 20-миллилитровые аликвоты закалочного буфера и храните их при минус 80 градусах Цельсия. Одновременно готовят радиомаркировку путем добавления натриевой соли уксусной кислоты в свободные от декстрозы sc среды в конечной концентрации 10 микрокюри на миллилитр.
Соберите клетки путем центрифугирования при 4, 100 х г в течение 10 минут. Удалите супернатант и промыть гранулу клетки один раз 20 миллилитрами среды SC, свободной от декстрозы. Соберите клетки снова путем центрифугирования при 4, 100 х г в течение пяти минут и перенесите их в меченую двухмиллилитровую микроцентрифужную трубку с использованием декстраусной свободной среды.
Центрифугировать ячейки еще на две минуты. Повторно суспендировать клетки в 500 микролитрах сред SC без декстрозы и начать период радиомаркировки, быстро добавив 500 микролитров радиомаркировой среды к каждой клеточной суспензии. Высиживать трубки во вращающемся инкубаторе при 30 градусах Цельсия в течение 20 минут.
Тем временем предварительно охладите центрифугу, оборудованную для 50 миллилитров конических трубок до минус 10 градусов Цельсия и разморозите одну 20-миллилитровую аликвоту закалочной буфера. Как только период радиомаркировки закончится, используйте пипетку, чтобы погрузить весь образец на один миллилитр в размороженный закалочный буфер на льду. Соберите гранулу ячейки, вращая в предварительно охлажденной центрифуге при 5 000 х г в течение трех минут и добавьте 20 миллилитров свежего буфера холодной закалки.
Вихрь и встряхните образцы, чтобы полностью повторно суспендировать их в буфере закалки и центрифугировать образцы снова, чтобы собрать клетки. После того, как клетки гранулированы, тщательно удалите весь закалочный буфер из образцов, выливая супернатант и удаляя излишки пипеткой. Храните тубы при минус 80 градусах Цельсия для дальнейшей обработки.
Взвесьте 0,3 грамма промытых кислотой стеклянных шариков для каждого образца и храните их в двух миллилитровых микроцентрифужных трубках на льду. Извлеките гранулы из морозильной камеры под минус 80 градусов и поместите их на лед. Затем добавьте 350 микролитров метанола и 700 микролитров хлороформа к каждому образцу и повторно суспендируют клетки.
Переложите их в микроцентрифужные трубки, содержащие предварительно взвешенные стеклянные шарики. Различает клетки, вихря три раза в течение одной минуты, с 30-секундной инкубацией на льду между волнениями. Перелейте ячейки в 15-миллилитровую стеклянную центрифужную трубку и пометьте трубку как трубку A.Промыте микроцентрифужную трубку одним миллилитром метанола, вихрьте ее и налейте метанол в трубку A.Добавьте два миллилитра хлороформа, а затем 400 микролитров воды в трубку A для окончательного объема образца 4,45 миллилитра.
Вращаем образцы в течение одной минуты с последующим пятиминутным центрифугированием при 1000 х г, чтобы четко разделить водные и органические фазы с клеточным мусором, лежащим на границе раздела. Используя стеклянную пастбищную пипетку, соберите органическую фазу в новую стеклянную центрифужную трубку с маркировкой B и добавьте один миллилитр одного молярного хлорида калия. Добавьте один миллилитр метанола и два миллилитра хлороформа в трубку А и повторите этапы вихря и центрифугирования.
Вихревая и центрифужная трубка B для разделения водной и органической фазы. Удалите верхний водный слой и соберите весь нижний органический слой в стеклянный флакон на четыре миллилитра. Полностью испарите растворитель из липидных экстрактов путем сушки под инертным газом и разогрейте духовку до 145 градусов Цельсия для нагрева пластины TLC.
Определите относительное количество радиомеблоки, позолочив ячейки, прежде чем загружать их на пластину TLC. Восстановить образец липидов в 40-50 микролитрах хлороформа и метанола, смешанных в соотношении один к одному, путем вихря в течение пяти минут. Готовят 101 миллилитр растворителя подвижной фазы в стеклянном градуированном цилиндре.
Затем налейте растворитель в стеклянную камеру TLC, содержащую прокладку для насыщения 20 на 20 TLC и плотно прилегающую крышку. Подготовьте канальный лист силикагеля 60 Г 20 на 20 и отметьте карандашом линию на высоте 1,5 сантиметра над нижней частью пластины. После того, как пластина будет достаточно нагрета и прокладка для насыщения TLC насытится растворителем, снимите пластину TLC из печи и немедленно приступайте к ее загрузке.
С помощью пипетки нанесите пять микролитров образца на начало каждой полосы, расположенной на 1,5 сантиметра выше нижней части пластины TLC, и повторите загрузку до тех пор, пока в каждую полосу не будет загружено от 20 до 40 микролитров образца. После того, как стандарт и образцы были загружены, поместите пластину в развивающуюся камеру и подождите, пока растворитель не достигнет верхней части пластины. Когда пластина будет полностью развита, извлеките ее из камеры и дайте ей высохнуть в вытяжном вытяжке в течение 20 минут.
После того, как пластина высохнет, накройте ее полиэтиленовой пленкой и поместите в развивающуюся кассету с экраном для авторерадиографии. Извлеките экран из развивающей кассеты и поместите его внутрь люминофорного томообразователя. Распылите на пластину TLC реагент p-Anisaldehyde до тех пор, пока кремнезем не насытится, затем выпекайте его в духовке при 145 градусах в течение пяти минут или до появления полос.
Чтобы количественно оценить липидные виды, соскоблите силикагель, содержащий отдельные липидные виды, и перенесите их в стеклянные сцинтилляционные флаконы. Добавьте шесть миллилитров сцинтилляционной жидкости и энергично вихряйте, пока кварцевая полоса не уменьшится до мелких кусочков. Поместите стойку со сцинтилляционными флаконами в сцинтилляционный счетчик и посчитайте, отрегулировав время подсчета до двух минут на флакон.
Люминофорная визуализация позволяет визуализировать ауторадиограмму безметочных жирных кислот, триацилглицерина, диацилглицерина, холестерина и сквалана. Показано, что очищенные липидные виды могут быть отделены в этом методе и впоследствии визуализированы путем распыления пластины TLC реагентом p-анисальдегида. Визуализированные виды включают все ранее упомянутые липиды в дополнение к стерильным эфирам.
Применяя 10-минутный период погони в бездиабельных средах после пульса, наблюдалось, что в основном бассейне сквалан исчез, а общий холестерин был повышен. Аналогичным образом, появление диацилглицерина в период погони коррелировало со снижением сигнала свободных жирных кислот. Прежде чем выполнять полный протокол, важно определить, будут ли клетки поглощать радиомебель уксусной кислоты в условиях роста и генетическом фоне, представляющих интерес.
