Этот протокол использует обнаружение показателя преломления для измерения побочных продуктов метаболизма углерода, которые обычно накапливаются в бесклеточных системах на основе лисата. Он также использует масс-спектрометрию для обнаружения еще более широкой панели центральных метаболитов, которые генерируются в метаболически активных лизатах. Два метода, используемые в настоящем протоколе, обеспечивают возможность количественного описания химических реакций, происходящих в бесклеточной системе на основе лисата, что позволяет обнаруживать более широкий спектр метаболитов, включая те, которые присутствуют при низких концентрациях в сложном лисатном фоне.
Демонстрировать процедуры будут Хайме Лоренцо Дингласан и Дэвид Ривз, аспиранты-исследователи из Отдела биологических наук. Начните с объединения различных компонентов в 1,5-миллилитровых микроцентрифужных пробирках для подготовки конечных реакций с 4,5 миллиграммами на миллилитр общего белка лизата. Подготовьте бесклеточную метаболическую инженерию, или CFME, реакции с конечными объемами 50 микролитров в трех литрах в расчете на момент времени.
Немедленно прекратите трипликатные реакции в соответствующих временных точках, добавив равный объем 5% трихлоруксусной кислоты к конечному реакционному объему каждого образца. Затем разбавьте каждый образец, добавив в два раза больше стерильной воды к каждой реакционной смеси. Чтобы рекапитулировать нулевое время, смешайте тот же объем 5% трихлоруксусной кислоты, что и общий конечный объем реакции с лизатом, прежде чем добавлять остальные компоненты реакции.
Эта ступень подкисления осаждает ферменты лизата, прежде чем они значительно метаболизируют глюкозу. Вращайте образцы и центрифугу на настоечную микроцентрифугу в 11, 600 раз в г в течение пяти минут и перенесите супернатанты, содержащие органические аналиты, в чистые пробирки. Храните образцы при температуре минус 20 градусов по Цельсию, если анализ ВЭЖХ будет проведен позже.
Убедитесь, что хранящиеся образцы разморажены на льду, прежде чем переходить к следующему шагу. Фильтруйте каждый супернатант с помощью порового фильтра 0,22 микрометра. После центрифуги переложите каждый фильтрат в чистый стеклянный флакон ВЭЖХ.
Загрузите флаконы в лоток автоподборника системы ВЭЖХ, которая уже настроена для анализа. В строке меню выберите Последовательность, Новый шаблон последовательности. Выберите Последовательность.
Сохраните шаблон последовательности как имя шаблона последовательности S.Select Sequence, Sequence Table. Добавьте N строк, соответствующих N флаконов. Затем введите позиции флакона и имена образцов в разделе «Имя флакона» и «Имя образца» соответственно, в соответствии с их расположением на лотке автозаборника.
Выберите метод, сгенерированный в соответствии с описанием в рукописи, из раскрывающегося меню Название метода и введите 50 микролитров в качестве инъекции на флакон для каждой строки. Нажмите кнопку Применить и сохраните шаблон последовательности, выбрав Последовательность, Сохранить шаблон последовательности. Убедитесь, что шаблон последовательности загружен, выбрав Sequence, Load Sequence Template, имя шаблона последовательности S.После достижения стабильной базовой линии на онлайн-графике щелкните правой кнопкой мыши панель RID Module, Control, Off Recycling Valve, чтобы направить поток растворителя через детектор RID в отходы.
Чтобы начать сбор данных, выберите Sequence в строке меню, а затем выберите Sequence Table, Run. Выберите представление Анализ данных в меню Вид. Найдите имя файла последовательности в списке файлов в левой части экрана.
На центральной панели экрана перейдите в области Выбор представления сигнала, Сигнал RID для просмотра образцов хроматограмм. Выберите строку, соответствующую любому из примеров, на верхней панели экрана. Пики, соответствующие целевым аналитам, будут расположены вдоль оси времени удержания в виде глюкозы, сукцината, лактата, формиата, ацетата и этанола в образцах, где присутствуют все эти метаболиты.
Различайте, хорошо ли интегрированы пики интереса программным обеспечением. Красная линия должна быть автоматически нарисована в качестве основы каждого пика. Если красная линия неровная, автоматическая интеграция не удалась.
Затем нажмите кнопку «Ручная интеграция» в наборе инструментов интеграции и вручную нарисуйте пиковую базу, чтобы интегрировать пиковую область. Выберите инструмент «Курсор» из общего набора инструментов, чтобы щелкнуть по правильно интегрированным пикам. Область пика и соответствующее время реакции выбранного пика будут выделены в виде строки таблицы на нижней панели экрана.
Чтобы экспортировать пиковые области, выберите Файл, Экспорт, Результаты интеграции. Построение значений пиковой площади в сопоставлении с известными концентрациями образцов в электронной таблице. Щелкните правой кнопкой мыши по нанесенным данным и выберите Добавить линию тренда, Формат линии тренда, Отобразить уравнение на графике.
В отдельной электронной таблице используйте уравнения стандартных линий тренда кривой для преобразования значений пиковой площади в концентрации для каждого анализируемого вещества из каждой выборки. Рассчитайте средние пиковые области и стандартные значения ошибок в трех значениях для визуализации данных. Установите тройные реакции за точку времени, за исключением нулевого времени, на льду, как описано в рукописи.
Вместо глюкозы используйте конечную концентрацию 100-миллимолярной глюкозы-13C6 в реакциях. Инкубируют реакции при 37 градусах Цельсия в течение одного, двух и трех часов. Для начала анализа пипетку на каждый образец высыпают эквивалентный объем экстракционного растворителя.
Если образцы были заморожены, добавьте экстракционный растворитель до того, как образцы полностью разморозятся, чтобы предотвратить реактивацию метаболизма глюкозы. Выполните все этапы обработки образцов на льду. Чтобы рекапитулировать нулевое время, пипетку окончательного объема экстракционного растворителя до соответствующего объема лизата для желаемой конечной концентрации 4,5 миллиграмма на миллилитр в 50 микролитрах реакционного объема.
Добавьте остальные компоненты реакции, как описано выше. Эта ступень подкисления осаждает ферменты лизата, прежде чем они значительно метаболизируют глюкозу. Инкубировать образцы в экстракционном растворителе на льду в течение 30 минут с легким встряхиванием.
Затем центрифугируют образцы в 21 000 г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия, чтобы отделить супернатант от осажденного белка. Переложите 50 микролитров супернатанта на флаконы автосамплера и загрузите флаконы на лоток в пределах четырех градусов Цельсия автопросэмплера. После подготовки прибора к анализу настройте последовательность выполнения с помощью программного обеспечения для сбора и интерпретации данных системы LC-MS/MS.
В Roadmap, Sequence Setup щелкните правой кнопкой мыши таблицу, чтобы вставить столько строк, сколько образцов. Для каждого ряда установите объем впрыска в пять микролитров, а положение — соответствующее положение флакона на лотке автопробоотборника. Введите имена файлов в качестве имен образцов и задайте требуемый путь к файлу для результатов выполнения.
Чтобы начать запуск, выделите все имена файлов в последовательности. В строке меню выберите Действия, Выполнить последовательность. Откройте MZmine и импортируйте необработанные выходные файлы, полученные ранее.
В строке меню выберите Методы необработанных данных, Импорт необработанных данных и выберите файлы, соответствующие образцам. Выполните действия, описанные в рукописи, чтобы завершить анализ MZmine. Экспортируйте необработанные пиковые области в конце анализа MZmine в виде CSV-файла.
Откройте электронную таблицу, чтобы рассчитать массы меченых 13C метаболитов из метаболизма глюкозы для целевого поиска. Используйте рассчитанные массы метаболитов, меченых 13C, для поиска и аннотирования характеристик массы заряда из результатов MZmine. Вручную проверьте спектры предполагаемой аннотации в качественном браузере, чтобы подтвердить аннотации.
Откройте дорожную карту, Qual Browser. На панели инструментов откройте необработанный файл, чтобы импортировать необработанные MS-данные каждого образца. Провести линию под нужным диапазоном времени удержания, соответствующим предполагаемой аннотации на общей ионной хроматограмме, чтобы просмотреть массовый спектр.
В экспериментах ВЭЖХ-РИД глюкоза потреблялась в течение первых трех часов реакции и в основном ферментировалась до лактата. Накопление этанола также значительно происходило в течение первых трех часов реакции и после этого прекращалось. Ацетат первоначально присутствовал в реакциях в качестве компонента буфера S30 и накапливался только из-за метаболизма через шесть часов, когда потребление глюкозы замедлилось.
Таким образом, лактат и этанол можно рассматривать как основные конечные продукты ферментации в бесклеточном метаболизме глюкозы на основе лисата. Было отмечено, что как фориат, так и сукцинат синтезируются в качестве незначительных продуктов ферментации. Глюкоза-13C6 наблюдалась при гликолизе, о чем свидетельствуют колебания гликолитических промежуточных продуктов.
В соответствии с данными обнаружения показателя преломления ВЭЖХ глюкоза накапливалась до лактата-13C3, а также ферментировалась до сукцината-13C3 в течение первых трех часов реакции. Также наблюдалось включение углерода, полученного из глюкозы-13C6, в сахарные фосфаты 6-фосфоглюконолактон, 6-фосфоглюконат, рибулоза-5-фосфат и седогептулоза-7-фосфат, что подтверждает участие пентозофосфатного пути в метаболизме глюкозы лизата. Было обнаружено, что метаболизм глюкозы лисата питает синтез тирозина-13C9, а также обеспечивает предшественник для производства гистидина-13C5.
Важно, чтобы контрольные образцы точно представляли нулевое время. Поэтому убедитесь, что белки в лизате инактивированы перед смешиванием в растворе, содержащем источники энергии. Также убедитесь, что автоматическая интеграция пиков из тестовых образцов, контрольных образцов и стандартов также согласована, чтобы извлеченные пиковые области были сопоставимы.
