Этот метод позволяет разобщить каждую фарингеационную арку. Эндотелиальные номера клеток могут быть количественно в каждой арке в качестве средства для изучения фарингеальной арки развития артерии. Основными преимуществами такого подхода являются способность визуализировать связь между различными сосудистыми структурами и способность количественно определять, как структуры повлияли на мутантов.
Аортические арчные артерии обычно мутируют при врожденных пороках сердца. Наш метод позволяет изучать, как мутации изменяют физиологический процесс формирования и ремоделирования сосудов. Хотя мы используем этот метод, чтобы получить представление о механизмах врожденного порока сердца, он может быть применен к другим системам, особенно с появлением световой микроскопии.
Начните с использования стеклянной пипетки для передачи каждой мыши эмбрионального дня 9,5 или 10,5 эмбриона в отдельные две миллилитровые трубки, содержащие один миллилитр PBS. После фиксации используйте тонкие щипси, чтобы тщательно ущипнуть эмбрион чуть выше задней части и сделать поперечный разрез, чтобы удалить заднюю половину эмбриона. Чтобы пронизать эмбрионы, замените PBS с PBST и поместите эмбрионы на четыре градуса цельсия с нежным возбуждением на ночь.
На следующий день замените PBST 600 микролитров блокирующего буфера, не касаясь эмбрионов для 16-18-часовой инкубации при четырех градусах Цельсия с нежным возбуждением. На следующее утро замените блокирующий буфер на 600 микролитров первичного антитела интереса на трубку на четырех-пятидневную инкубацию при четырех градусах Цельсия с нежным возбуждением. В конце инкубации, мыть эмбрионы в один миллилитр PBST в течение четырех-пяти часов с нежным возбуждением при комнатной температуре изменения PBS каждый час, а затем ночь инкубации в свежем PBST при четырех градусах по Цельсию и четыре-пять дополнительных один час моет на следующий день.
После последней стирки замените PBST в каждой трубке 600 микролитров соответствующего вторичного раствора антител для четырех-пятидневной инкубации при четырех градусах Цельсия. В конце инкубации, мыть эмбрионы в один миллилитр свежего PBST за стирку, как только что продемонстрировали и использовать стеклянную пипетку, чтобы аккуратно перенести каждый эмбрион в отдельных пластиковых форм парафина. Тщательно удалите любой PBST вокруг каждого эмбриона и сориентировать каждый эмбрион в сагиттальном положении.
Затем быстро добавить около 500 микролитров горячей агарозы в каждой форме, пока каждый эмбрион просто покрыты и место формы на льду, покрытом алюминиевой фольгой, пока агароза затвердеет. Для обезвоживания эмбриональных образцов используйте чистый скальпель, чтобы разрезать блок агарозы вокруг каждого эмбриона и использовать типсы, чтобы схватить агаросу для переноса в помеченную двухми миллилитровую трубку, содержащую один миллилитр 25%метанола. После часовой инкубации с нежным возбуждением в темноте замените 25%-ный метанол одним миллилитром 50%метанола на трубку для дополнительной часовой инкубации в темноте.
После окончания обезвоживания замените 100%-ный метанол одним миллилитром 50%BABB для часовой инкубации с нежным возбуждением в темноте. В конце инкубации замените 50%BABB на один миллилитр 100%BABB на трубку для часовой инкубации с нежным возбуждением в темноте, а затем второй инкубацией со 100%BABB, как только что продемонстрировано. Чтобы смонтировать эмбрионы для визуализации, снимите клей с быстрой бампера и поместите бампер на 24 на шесть миллилитров число 1,5 стеклянные крышки.
Нанесите мягкое давление на клей, чтобы удалить любые пузырьки воздуха между крышкой и бампером и тщательно отбросить 100%BABB от каждой трубки. Затем используйте тонкие типсы, чтобы тщательно перенести эмбрион в быстрый колодец, не касаясь эмбриона и поместите второй крышку на бампер. Чтобы выть эндотелий во всю третью фарингеационную арку, откройте изображение, представляющие интерес для программного обеспечения, и нажмите добавить новую поверхность.
Двойной щелчок поверхности один и переименовать новую поверхность в третью фарингеальной арки. Выберите автоматическое создание пропустить, редактировать вручную, и установить ориентацию поверхности на плоскости Y. Используйте положение ломтика для того чтобы поместить третью плоскость поверхности арки pharyngeal к где третья PAA и спинная аорта соединяют.
Поверните изображение так, чтобы третья фанингальная плоскость поверхности арки была в поле зрения и выключите срез орто. В режиме контура рисования выберите функцию режима рисования расстояния и при необходимости отрегулируйте настройки параметра. Когда все параметры будут установлены, нажмите клавишу Escape и нажмите рисовать, чтобы проследить периметр третьей фарингальной арки с курсором мыши.
Затем используйте положение ломтика, чтобы переместить от 10 до 25 ломтиков и проследить периметр фарингеальной арки. Когда вся арка была прослежена, нажмите создать поверхность для создания поверхности трассировки области. Для маскировки всплыли структуры, в меню редактирования, выберите выбор маски для третьего PAA и DAPI и нажмите OK. Затем переименуй новый канал в PAA DAPI.
Повторите этот шаг для остальных каналов. Чтобы визуализировать эндотелиальное сплетение отдельно от PAA, выберите выбор маски для третьего PAA и выберите DAPI. Uncheck выберите voxels внешней поверхности и проверить выберите voxels внутри поверхности.
Установите выберите voxels внутри поверхности до нуля и нажмите OK. Переименовать новый канал как не-PAA DAPI. Повторите этот шаг для остальных каналов. Выберите выбор маски для третьего PA и выберите не-PAA DAPI и нажмите OK. Переименовать новый канал как сплетение DAPI.
Повторите этот шаг для остальных каналов. Для количественной оценки отдельных эндотелиальных ячеек в каждой структуре интереса, в панели регулировки дисплея, выключите все каналы, кроме канала PAA ERG. В меню свойств нажмите добавить новые пятна и нажмите кнопку, чтобы переименовать пятна одного PAA общее количество эндотелиальных ячеек.
Нажмите на синюю стрелку и выберите канал PAA ERG для источника канала. Отрегулируйте предполагаемый диаметр XY до четырех микрометров и нажмите на синюю стрелку, чтобы перейти к следующей панели. Используйте скользящую шкалу, чтобы скорректировать количество пятен, чтобы гарантировать, что каждое положительное эндотелиальное ядро клетки ERG представлено одним пятном.
Затем нажмите зеленую двойную стрелку и выключите канал PAA ERG в панели регулировки дисплея. Включите канал PAA VEGFR2, чтобы визуализировать эндотелий PAA и нажмите редактировать и добавлять/удалять, чтобы выбрать поверхность объекта. Затем нажмите Escape и удерживайте Shift, чтобы удалить любые пятна, которые не являются положительными VEGFR2, и нажмите на вкладку статистики, чтобы определить общее количество эндотелиальных ячеек.
Целый крепление иммунофторесценции дает четкие и чистые результаты, позволяющие 3D-реконструкцию фарингеальной арки эндотелия. На этом изображении наличие больших ярких точек является результатом твердых частиц в антителах или блокирующих буферных растворах. После фарингальной арки и окрашивания поверхности ПАА использование функции маски позволяет визуально отделить и независимо проанализировать поверхностные области.
Маскировка также позволяет индивидуальный анализ и количественную оценку эндотелиальных номеров клеток в каждой структуре. Например, здесь функция пятна была использована для количественной оценки общего числа эндотелиальных клеток как в ПАА, так и в сплетении, назначив одно место для каждого ядра, выражаюго ERG. На этом изображении можно наблюдать положительное отрицательное пятно ERG VEGFR2, которое было создано спотовой функцией.
Поэтому необходимо проверить, что каждая точка, распознаемая программным обеспечением, на самом деле представляет собой единую эндотелианую ячейку. Чтобы получить чистые и четкие изображения, не забудьте спина вниз все решения и правильно и тщательно мыть каждый эмбрион после инкубации антител. Важно помнить, что BABB является коррозионным и токсичным.
Ручка и отказаться от растворителя должным образом и не забудьте запечатать расплавленных эмбрионов полностью, чтобы предотвратить утечку BABB.
