تسمح هذه الطريقة لكل قوس بالبُل أن تكون مجزأة. ويمكن بعد ذلك أن أرقام الخلايا البطانية يمكن قياسها كميا في كل قوس كوسيلة لدراسة تطور الشريان القوسي البلعوم. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذا النهج في القدرة على تصور العلاقة بين مختلف الهياكل الوعائية والقدرة على تحديد كيفية تأثير الهياكل على المسوخ كمياً.
عادة ما تحور الشرايين القوس الأبهري في أمراض القلب الخلقية. يسمح أسلوبنا بدراسة كيفية تغيير الطفرات في العملية الفسيولوجية لتكوين السفينة وإعادة عرضها. على الرغم من أننا نستخدم هذه الطريقة للحصول على رؤى في آليات أمراض القلب الخلقية، يمكن تطبيقها على أنظمة أخرى خاصة مع ظهور المجهر ورقة الضوء.
ابدأ باستخدام ماصة زجاجية لنقل كل يوم جنيني ماوس 9.5 أو 10.5 جنين إلى أنابيب ميليلتر فردية تحتوي على ملليلتر واحد من PBS. بعد التثبيت، استخدم ملقطًا ناعمًا لقرصة الجنين بعناية فوق الظهر وقم بقطع عرضية لإزالة النصف الخلفي من الجنين. ل Permeabilize الأجنة، واستبدال برنامج تلفزيوني مع PBST ووضع الأجنة في أربع درجات مئوية مع التحريض لطيف بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي، استبدل برنامج PBST بـ 600 ميكرولترات من عازلة الحجب دون لمس الأجنة لاحتضان لمدة 16 إلى 18 ساعة بأربع درجات مئوية مع هياج لطيف. في صباح اليوم التالي، استبدل عازلة الحجب بـ 600 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية ذات الاهتمام لكل أنبوب لاحتضان لمدة أربعة إلى خمسة أيام عند أربع درجات مئوية مع هياج لطيف. في نهاية الحضانة ، وغسل الأجنة في ملليلتر واحد من PBST لمدة أربع إلى خمس ساعات مع التحريض لطيف في درجة حرارة الغرفة تغيير برنامج تلفزيوني كل ساعة ، تليها حضانة بين عشية وضحاها في PBST الطازجة في أربع درجات مئوية وأربعة إلى خمس يغسل ساعة واحدة إضافية في اليوم التالي.
بعد الغسيل الأخير، استبدل برنامج PBST في كل أنبوب بـ 600 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة الثانوي المناسب لاحتضان لمدة أربعة إلى خمسة أيام عند أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة، وغسل الأجنة في ملليلتر واحد من PBST الطازجة في غسل كما أظهرت للتو واستخدام ماصة زجاجية لنقل بلطف كل جنين في قوالب البارافين البلاستيكية الفردية. قم بإزالة أي PBST من حول كل جنين بعناية وتوجيه كل جنين في وضع القوس.
ثم إضافة بسرعة حوالي 500 ميكرولترات من agarose الساخنة إلى كل قالب حتى يتم تغطية كل جنين فقط ووضع القوالب على الجليد مغطاة رقائق الألومنيوم حتى وقد توطد agarose. لجفاف العينات الجنينية، استخدم مشرط نظيف لقطع كتلة من الأغاروز حول كل جنين واستخدام ملقط لفهم agarose لنقلها إلى أنبوب مليلتر المسمى يحتوي على ملليلتر واحد من 25٪ الميثانول. بعد حضانة لمدة ساعة واحدة مع التحريض لطيف في الظلام، استبدال 25٪ الميثانول مع ملليلتر واحد من 50٪ الميثانول لكل أنبوب لاحتضان ساعة إضافية في الظلام.
بعد نهاية الجفاف، استبدال الميثانول 100٪ مع ملليلتر واحد من 50٪ BABB لاحتضان لمدة ساعة واحدة مع التحريض لطيف في الظلام. في نهاية الحضانة، استبدال 50٪ BABB مع ملليلتر واحد من 100٪ BABB لكل أنبوب لاحتضان لمدة ساعة واحدة مع التحريض لطيف في الظلام، تليها حضانة ثانية مع 100٪ BABB كما هو موضح للتو. لتركيب الأجنة للتصوير، وإزالة لاصقة من الوفير جيدا سريع ووضع المصد على 24 في ستة ملليلتر رقم 1.5 غطاء الزجاج.
تطبيق ضغط لطيف على لاصق لإزالة أي فقاعات الهواء بين غطاء والمصد وتجاهل بعناية 100٪ BABB من كل أنبوب. ثم استخدم ملقط غرامة لنقل بعناية الجنين إلى البئر سريع دون لمس الجنين ووضع غطاء الثاني على المصد. لسطح بطانة في قوس البلعوم الثالث بأكمله ، افتح صورة الاهتمام في البرنامج وانقر فوق إضافة سطح جديد.
انقر نقرا مزدوجا فوق سطح واحد وإعادة تسمية السطح الجديد إلى قوس البلعوم الثالث. حدد تخطي الإنشاء التلقائي، وتحريره يدويًا، وتعيين اتجاه السطح إلى مستوى YZ. استخدم موضع الشريحة لوضع سطح قوس البلعوم الثالث إلى حيث يتصل PAA الثالث والأبهرتي الظهري.
تدوير الصورة بحيث الثالث في عرض سطح قوس البلعوم الطائرة في عرض وإيقاف تقطيع العظام. ضمن وضع رسم كفاف، حدد وظيفة وضع رسم المسافة وقم بضبط إعدادات المعلمة حسب الضرورة. عندما تم تعيين كافة المعلمات، اضغط على مفتاح Escape وانقر فوق رسم لتتبع محيط القوس الثالث البلعوم مع مؤشر الماوس.
ثم استخدم موضع الشريحة لتحريك 10 إلى 25 شريحة وتتبع محيط قوس البلعوم. عندما تم تتبع القوس بأكمله، انقر فوق إنشاء سطح لتوليد سطح المنطقة تتبع. لإخفاء البنيات الظاهرة، في قائمة التحرير، حدد تحديد قناع لـ PAA و DAPI الثالث ثم انقر فوق موافق. ثم أعد تسمية القناة الجديدة باسم PAA DAPI.
كرر هذه الخطوة للقنوات المتبقية. لتصور الضفيرة endothelial بشكل منفصل عن PAA، حدد اختيار قناع PAA الثالث وحدد DAPI. قم بإلغاء تحديد voxels خارج السطح إلى والتحقق من تحديد voxels داخل السطح إلى.
تعيين تحديد voxels داخل السطح إلى الصفر وانقر فوق موافق. إعادة تسمية القناة الجديدة باسم DAPI غير PAA. كرر هذه الخطوة للقنوات المتبقية. حدد قناع التحديد لـ PA الثالث وحدد غير PAA DAPI ثم انقر فوق موافق. إعادة تسمية القناة الجديدة كـ DAPI الضفيرة.
كرر هذه الخطوة للقنوات المتبقية. لتحديد عدد الخلايا البطانية الفردية داخل كل بنية ذات فائدة، في لوحة تعديلات العرض، قم بإيقاف تشغيل جميع القنوات باستثناء قناة PAA ERG. ضمن قائمة الخصائص، انقر فوق إضافة بقع جديدة وانقر لإعادة تسمية البقع PAA عدد إجمالي من الخلايا البطانية.
انقر فوق السهم الأزرق وحدد قناة PAA ERG للقناة المصدر. ضبط قطر XY المقدرة إلى أربعة ميكرومتر وانقر فوق السهم الأزرق للمتابعة إلى اللوحة التالية. استخدم المقياس الانزلاقي لضبط عدد البقع لضمان تمثيل كل نواة خلية بطانةية إيجابية من قبل نقطة واحدة.
بعد ذلك، انقر فوق السهم المزدوج الأخضر ثم قم بإيقاف تشغيل قناة PAA ERG في لوحة ضبط الشاشة. تشغيل قناة PAA VEGFR2 لتصور endothelium PAA وانقر فوق تحرير وإضافة / حذف لتحديد سطح الكائن. ثم اضغط على الهروب مع الاستمرار في الضغط على Shift لحذف أي بقع ليست VEGFR2 موجبة وانقر فوق علامة التبويب الإحصائيات لتحديد العدد الإجمالي للخلايا البطانية.
ينتج عن الفلور المناعية الكاملة نتائج واضحة ونظيفة تسمح بإعادة بناء 3D للـ endothelium القوس البلعوم. في هذه الصورة، وجود النقاط الساطعة الكبيرة هو نتيجة للجسيمات في الأجسام المضادة أو حلول العازلة حظر. بعد قوس البلعوم و PAA تلطيخ السطح، واستخدام وظيفة قناع يسمح للمناطق على السطح أن تكون منفصلة بصريا وتحليلها بشكل مستقل.
كما يسمح الإخفاء بتحليل فردي و تحديد أرقام الخلايا البطانية داخل كل بنية. على سبيل المثال، هنا تم استخدام ميزة البقعة لتحديد العدد الإجمالي للخلايا البطانية في كل من PAA والplexus عن طريق تعيين نقطة واحدة لكل نواة تعبر عن ERG. في هذه الصورة، يمكن ملاحظة نقطة سالبة VEGFR2 إيجابية من ERG تم إنشاؤها بواسطة وظيفة موضعية.
لذلك، من الضروري التحقق من أن كل نقطة معترف بها من قبل البرنامج تمثل في الواقع خلية واحدة endothelial. للحصول على صور نظيفة وواضحة، تذكر أن تدور أسفل جميع الحلول وغسل كل جنين بشكل صحيح وبدق بعد حضانات الأجسام المضادة. من المهم أن نتذكر أن BABB هو تآكل وسامة.
التعامل مع والتخلص من المذيبات بشكل صحيح وتأكد من ختم الأجنة الذائبة تماما لمنع تسرب BABB.
