Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смерти во всем мире. Мыши модели являются полезными инструментами для изучения этого заболевания и наш протокол может быть использован для количественной оценки атеросклероза у мышей. Используя этот протокол, размер поражения может быть измерен в трех сосудистых местах.
Корень аорты, арку аорты и брахиоцефалическую артерию. Количественная оценка атеросклероза у мышей может быть утомительной задачей. Мы представили подробные шаги, которые, как мы надеемся, могут ускорить этот процесс.
Некоторые из этих шагов трудно описать в письменной форме. Мы надеемся, что это видео поможет вам в получении надежного анализа размера атеросклеротических поражений. После сбора сердца мыши в соответствии со стандартными протоколами, поместите сердце на пробковую кровать, брюшной стороне под рассечение микроскопа и использовать иглу, чтобы исправить сердце пробки через вершину.
Удерживая основание сердца анатомическими типсами, используйте скальпель, удерживаемый под углом 20 градусов в сагиттаальной плоскости, и 20 градусов черепно-мозговой в поперечной плоскости, чтобы отрезать апикал две трети сердца. Вставлять корень аорты и основание сердца в оптимальное соединение температуры резки, или OCT, и осторожно сжать сердце с типсами, чтобы заполнить корень аорты с соединением и удалить любые пузырьки воздуха. Перенесите образец на дно криомольда, наполненного OCT с корнем аорты перпендикулярно нижней поверхности и заморозить соединение на сухом льду.
Затем храните образец ткани в морозильной камере при температуре минус 80 градусов по Цельсию до криозирования. Чтобы подготовить закрепление кровати для анализа лица, сложите сегмент парафиновой восковой пленки восемь раз, чтобы сделать плоскую поверхность 25 на 25 мм и оберните черную электрическую изоляционные ленты вокруг пленки, чтобы сделать темный фон для аорты. Поместите этикетку на задней стороне зажатой кровати и используйте карандаш для записи идентификационного номера мыши.
Перенесите арку аорты на закрепление кровати и добавьте каплю PBS в ткань. Используя стерео микроскоп, очистить аорту от оставшихся периаддентиальной жировой ткани и использовать Ножницы Vannas и Dumont типсы, чтобы аккуратно очистить все окружающие жировой ткани без манипулирования или повреждения аорты. Затем ввеми ножницы Vannas в аортальный люмен, чтобы разоблачить интимную поверхность.
Начните резать внешнюю кривизну восходящей арки в дистальной направлении, продолжая разрезать ветви, в том числе брахиоцефалической артерии и щадя спинной части нисходящей грудной области. Чтобы отобразить интимную поверхность, разрежьте меньшую кривизну и сложите аорту. Используя микро Castroviejo держатель иглы, обеспечить открытую арку к зажатой кровати с тупым концом minuten насекомых булавки без растяжения образца, мягко изгиб булавки от образца, как ткань проводится на месте.
Затем храните закрепленную арку лицом вниз в чашке Петри PBS при четырех градусах по Цельсию. Для Судана IV окрашивания, промыть образец в течение пяти минут в чашке Петри 70%этанола с аркой лицом вниз, прежде чем передать образец блюдо Судана IV рабочий раствор в течение семи минут. В конце инкубации, промыть образец с двумя трехминутными моет в 80%этанола, чтобы де-пятно нормальной интимальной поверхности, а затем окончательное полоскание в PBS, прежде чем вернуть ткань в исходное блюдо Петри.
Затем приобрети микрографы под стерео микроскопом, подключенным к цифровой камере при увеличении 10X, получая изображения закрепленной арки, погруженной в PBS, используя небольшие металлические веса, чтобы держать закрепление кровати на дне чашки Петри. Чтобы получить криозекции встроенного корня аорты, установите температуру криостата до минус 20 градусов по Цельсию, а толщину сечения до 10 микрометров. Намонтировать блок OCT, содержащий корень аорты на держателе образца с желудочковой тканью, обращенной наружу.
При необходимости закрекрете позиционирование дополнительными OCT. Корень аорты теперь должен быть расположен перпендикулярно лезвию ножа. Соберите начальные контрольные секции, содержащие сердечную мышечную ткань на обычных слайдах микроскопа, проверяя прогрессию через ткани каждые 200 микрометров под легким микроскопом.
Когда появится первый аортический cusp, наклоните образец к точке нулевой cusp, чтобы выровнять плоскость раздела с двумя другими cusps и рассчитывать каждые 10 микрометровый раздел, который вырезан из точки нуля года. Начните собирать секции для анализа с 90 микрометров и далее в соответствии с запланированной горкой, пока не будет достигнуто 800 микрометров от нулевой точки. Расчет доли поражения общей площади сосуда корня аорты делает данные менее чувствительными к возможным различиям в углах при разделе.
Кроме того, это может быть иллюстративным для расчета области под кривой или размер поражения атерото на мышь и представить данные в точку участка для дальнейшей визуализации отдельных вариаций в группах. Поражение липидного накопления может быть количественно по цвету пороговых нефти красный O положительные области общей области поражения. Правые и левые коронарные артерии обычно расходятся с аортой около 250 микрометров от аортальной пазухи, которая часто совпадает с наиболее заметными размерами поражения.
Удаление темного фона в репрезентативных изображениях аортических арок en face может улучшить визуальный дисплей. Размер поражения, как правило, обычно распределяется между группами, что позволяет статистический анализ с использованием студента t-тест между группами. Мы рекомендуем практиковать с некоторыми тестовым материалом, пока вы не получили достаточные навыки для обработки экспериментальных образцов.
Если размер поражения отличается между группами, вы должны определить механизм, как анализ состава поражения, как правило, следующий шаг, чтобы продолжить.
