Обнаружение всего реактивного кислорода видов в клеток-приверженцев 2',7'-Dichlorodihydroflucescein Диацетат окрашивания

Этот метод может быть использован для анализа клеточных реактивных видов кислорода в адептовых клетках только с флуоресцентным микроскопом, и количественно реактивной интенсивности видов кислорода с флуоресцентной пластины читателя. Этот протокол прост, эффективен и рентабельн. Начните с посева два раза от 10 до пятого HCT116 колоректальных раковых клеток в DMEM в каждый колодец 24-хорошо пластины.

Инкубировать клетки на ночь при 37 градусах по Цельсию. На следующий день замените культурную среду 100 микромолейными сульфатами феррода, или 10 микромолейными доксорубицинсодержащих средами, и инкубировать пластину еще на 24 часа. Подготовь решение DCFH-DA, растворив 4,85 миллиграмма DCFH-DA в одном миллилитре DMSO, чтобы сделать 10 миллимолярный раствор запаса.

Прямо перед добавлением его в скважины, разбавить бульон с предварительно разогретой DMEM, чтобы сделать 10 микромоляных рабочий раствор, и вихрь его в течение 10 секунд. Чтобы испачкать клетки, удалите лекарственно-содержащую среду и вымойте их один раз с помощью DMEM. Добавьте 500 микролитров рабочего раствора DCFH-DA в каждую колодец и инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут.

После инкубации, удалить DCFH-DA из колодцев, и мыть их дважды с DMEM, и один раз с PBS. Затем добавьте 500 микролитров PBS к каждой колодец. Используйте зеленый флуоресцентный белковый канал на флуоресцентном микроскопе, чтобы сделать репрезентативные изображения клеток.

Затем удалите PBS и добавьте 200 микролитров буфера анализа радиоиммунопрофильизации к каждой хорошо. Инкубировать пластину на льду в течение пяти минут, и собирать клетки лисирует в 1,5 миллилитров труб. Центрифуга труб при 21, 130 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.

Затем перенесите 100 микролитров супернатанта на черную пластину из 96 колодец. Используйте считыватель микроплатформы на восклицательный длина волны 485 нанометров и длину волны выбросов в 530 нанометров для измерения флуоресценции в каждой хорошо. Затем измерьте концентрацию белка с помощью анализа Брэдфорда, передав один микролитер супернатанта в четкую пластину 96-колодец со 100 микролитров раствора анализа белка.

Используйте концентрации белка для нормализации интенсивности флуоресценции. Колоректальные раковые клетки HCT116 лечились 100 микромолейными сульфатами, или 10 микромоларными доксорубицинами, чтобы вызвать окислительный стресс. Как и ожидалось, зеленая флуоресценция была резко увеличена в результате обоих процедур.

Для количественной оценки относительных изменений интенсивности клетки были облизированы и нормализовылись с концентрацией белка. Относительная интенсивность флуоресценции была значительно увеличена ферросульфатом или доксорубицином. При выполнении этой процедуры важно сделать решение DCFH-DA свежим и избежать воздействия света, а также свести к минимуму нарушение состояния клетки, а также выполнить обширную промывку PBS прямо перед съемкой изображения.

В дополнение к обнаружению общего ROS по этому протоколу, в частности ROS, таких как перекись может быть выполнена.