通过2'，7'-二氯二氢氟辛二乙酸染色检测粘附细胞中的总活性氧物种

该方法可用于分析附着细胞中的细胞活性氧物种，仅使用荧光显微镜，并用荧光板读卡器量化活性氧种强度。该协议简单、高效且经济高效。首先在DMEM中将两次10至第五个HCT116结肠直肠癌细胞播种到24井板的每个井中。

在37摄氏度下孵育细胞过夜。第二天，用100微摩尔硫酸铁或10微摩尔多索鲁比辛基基代替培养基，再孵育24小时。通过将 4.85 毫克的 DCFH-DA 溶解在一毫升的 DMSO 中，以制造 10 毫摩尔库存溶液，准备 DCFH-DA 解决方案。

在将库存添加到井中之前，用预热的 DMEM 稀释库存，使 10 微摩尔工作溶液，并旋转 10 秒。要弄脏细胞，请取出含药物的介质，用DMEM洗涤一次。将 500 微升 DCFH-DA 工作溶液添加到每个井中，并在 37 摄氏度下孵育板 30 分钟。

孵育后，从井中去除DCFH-DA，用DMEM洗涤两次，用PBS清洗一次。然后，在每井中加入500微升PBS。使用荧光显微镜上的绿色荧光蛋白通道拍摄细胞的代表性图像。

然后取出PBS，并在每井中加入200微升的放射性免疫沉淀测定缓冲液。在冰上孵育盘子五分钟，将细胞落酸收集到1.5毫升管中。在 4 摄氏度下将管在 21，130 次 G 下离心 10 分钟。

然后将 100 微升的上一液转移到黑色 96 井板中。使用 485 纳米的激发波长和 530 纳米的发射波长的微孔板读取器测量每孔的荧光。接下来，使用布拉德福德测定测量蛋白质浓度，将一微升的上清液转移到一个带100微升蛋白质测定溶液的透明96井板中。

使用蛋白质浓度使荧光强度正常化。HCT116结肠直肠癌细胞用100微摩尔硫酸铁或10微摩尔多索鲁比辛治疗，以诱导氧化应激。不出所料，这两种治疗方法都显著增加了绿色荧光。

为了量化相对强度的变化，细胞被分析，用蛋白质浓度进行规范化。硫酸铁或多索鲁比辛相对荧光强度显著增加。执行此过程时，重要的是使 DCFH-DA 解决方案新鲜，避免光线照射，以及尽量减少细胞状态干扰，并在拍摄图像之前执行广泛的 PBS 洗涤。

除了通过本协议检测总 ROS 外，还可以执行过氧化物等 ROS。