الكشف عن مجموع أنواع الأكسجين التفاعلي في الخلايا المنضمة من قبل 2'،7'-ديكلوروديدروفلوريسين Diacetate تلطيخ

ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحليل أنواع الأكسجين التفاعلي الخلوية في الخلايا المتمسكة مع المجهر المفلور فقط، وقياس كثافة أنواع الأكسجين التفاعلية مع قارئ لوحة الفلوريسين. هذا البروتوكول بسيط وفعال وفعال من حيث التكلفة. ابدأ بذر مرتين 10 إلى الخلايا السرطانية القولونية HCT116 الخامسة في DMEM في كل بئر من 24 بئرًا.

احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، استبدل الوسيطة الثقافية بـ 100 كبريتات حديدية صغيرةمولار، أو 10 وسيط يحتوي على دوكسوروبيسين ميكرومولار، واحتضان الطبق لمدة 24 ساعة أخرى. إعداد حل DCFH-DA عن طريق حل 4.85 ملليغرام من DCFH-DA في ملليلتر واحد من DMSO لجعل حل مخزون 10 ملليمولار.

الحق قبل إضافته إلى الآبار، وتمييع الأسهم مع DMEM قبل الدافئة لجعل حل العمل 10 micromolar، ودوامة لمدة 10 ثوان. لطخة الخلايا، وإزالة المتوسطة التي تحتوي على المخدرات، وغسلها مرة واحدة مع DMEM. إضافة 500 ميكرولترات من DCFH-DA حل العمل في كل بئر، واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

بعد الحضانة، وإزالة DCFH-DA من الآبار، وغسلها مرتين مع DMEM، ومرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. ثم ، إضافة 500 ميكرولترers من برنامج تلفزيوني إلى كل بئر. استخدام قناة البروتين الفلورسنت الخضراء على المجهر الفلوريسنس لالتقاط صور تمثيلية للخلايا.

ثم إزالة برنامج تلفزيوني، وإضافة 200 ميكرولترات من العازلة فحص المناعة المشعة إلى كل بئر. احتضان لوحة على الجليد لمدة خمس دقائق، وجمع lysates الخلية في أنابيب 1.5 ملليلتر. الطرد المركزي الأنابيب في 21، 130 مرات G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.

ثم نقل 100 ميكرولترات من السوبر إلى لوحة سوداء 96 جيدا. استخدم قارئ الصهرات الصغيرة في الطول الموجي للإثارة من 485 نانومتر، وطول موجة من الانبعاثات من 530 نانومتر، لقياس الفلوروس في كل بئر. المقبل، وقياس تركيز البروتين مع مقايسة برادفورد عن طريق نقل ميكرولتر واحد من السوبر إلى لوحة واضحة 96 جيدا مع 100 ميكرولترات من محلول تحليل البروتين.

استخدام تركيزات البروتين لتطبيع شدة الفلوريسنس. تم علاج خلايا سرطان القولون والمستقيم HCT116 مع 100 كبريتات حديدية ميكرومولار، أو 10 دوكسوروبيسين ميكرومولار، للحث على الإجهاد التأكسي. كما هو متوقع، تم زيادة الفلورس الأخضر بشكل كبير من قبل كلا العلاجين.

لتحديد التغيرات الكثافة النسبية، تم lysed الخلايا وتطبيعها مع تركيزات البروتين. وقد زادت شدة الفلورسينس النسبية زيادة كبيرة بسبب كبريتات الحديد أو دوكسوروبايسين. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم أن تجعل DCFH-DA حل جديدة وتجنب التعرض للضوء، وكذلك للحد من اضطراب حالة الخلية، وأداء برنامج تلفزيوني واسعة غسل الحق قبل التقاط الصورة.

بالإضافة إلى الكشف عن إجمالي ROS بواسطة هذا البروتوكول، يمكن إجراء ROS على وجه التحديد مثل بيروكسيد.