Мы разработали новую модель 3D сфероидов, которая предлагает платформу для изучения раковых взаимодействий и тестирования терапии рака. На мой взгляд, эта 3D система сочетает в себе раковые клетки в стромы фибробласта, чтобы лучше имитировать подлинные условия опухоли и, следовательно, может быть очень мощным инструментом для обнаружения наркотиков. Кроме того, эта модель не ограничивается изучением меланомы.
Он может быть использован для исследования других видов рака. Демонстрацией процедуры будет доктор Хунвэй Шао, старший научный сотрудник из моей лаборатории. Для человеческой культуры клеток меланомы, бросить клетки под обычными условиями культуры клеток адепта и завершить W489 среды при 37 градусов по Цельсию в 5%углекислого газа.
Когда клетки достигнут 90%-го слияния, разделите клетки в соотношении один к пяти. Для мыши кожи фибробластов культуры, мыть собранные гранулы ткани в PBS до культивирования образцов и DMEM дополнены 10 процентов плода бычьего сыворотки, и один процент пенициллин-стрептомицин в инкубаторе клеточной культуры. Разделите клетки в соотношении один к двум, когда они достигнут 90-процентного слияния.
Прежде чем создать кокультуры, семена фибробластов на 100 миллиметров блюдо в концентрации, так что слияние клеток достигнет примерно 60 процентов на следующий день. На следующее утро замените супернатант концентрацией GFP от одного до трех до пяти к лентивирусу, разбавленному из бульона в обычной культурной среде, дополненной четырьмя микрограммами на миллилитр полибрена. Поместите клетки в инкубатор клеточной культуры в течение шести часов, прежде чем заменить супернатант свежей средой культуры.
Через два дня наблюдайте сигнал GFP от клеток на флуоресцентный микроскоп. Когда обе клеточные культуры были стабилико трансфицированы, отсоедините обе клеточные культуры от 0,25 трипсина-ЭДТА, чтобы собрать одноклеточные суспензии на центувигации. Повторно приостановить клетки в два раза от 10 до четвертого клеток на миллилитр средней концентрации кокультуры и смешать клетки меланомы и фибробласты в соотношении один к одному.
Затем посмотрите два миллилитров клеток на каждый колодец из 24 хорошо пластины и тройной для каждого состояния и поместите пластину в инкубатор культуры клеток в течение четырех часов, чтобы клетки, чтобы прикрепить к нижней пластины. Для меланомы клеточной соло культуры для оценки образования 2D-клеточных кластеров, увидеть два раза от 10 до четвертой клетки меланомы в каждый колодец из 24 хорошо пластины и культуры клеток в течение семи до 10 дней в инкубаторе клеточной культуры. Затем сфотографируют клетки на перевернутом флуоресцентном микроскопе в соответствии со стандартными протоколами флуоресцентной микроскопии.
Если система визуализации промежуток времени выключена, включите ее по крайней мере за час до начала изображения. Когда система будет готова, тщательно перенесите культурную пластину на стадию микроскопа и сдвиньте инкубатор и надежно заблокив дверь. Откройте программное обеспечение системы визуализации промежуток времени и нажмите добавить судно, чтобы выбрать тип пластины и производителя, чтобы микроскоп может найти область сканирования точно.
Выберите объектив 10 раз объектив и колодцы, представляющие интерес, и установите параметры области сканирования, интервал между сканированием и временем начала и окончания. Затем завехать промежуток времени изображения от четырех до 52 часов. В конце записи изображения используйте программное обеспечение системы визуализации замедленного действия для получения данных и экспорта собранных видео или наборов изображений.
Для конфокальных микроскопических изображений кокультур поместите пластину на стадию перевернутого микроскопа флуоресценции и выберите красные и зеленые лазерные лучи. Наблюдайте за клетками под целью 5 или 10 раз и выберите сфероид, чтобы начать сканирование. Используя один микрон z-шаг, сканирование снизу вверху сфероида.
Затем обработайте данные с помощью соответствующего программного обеспечения для обработки изображений для восстановления 3D-изображения, которое может быть дополнительно повернуто и сохранено в качестве 3D-фильма. Здесь показаны изображения многоклеточных 3D сфероидов, образованных кокультурными клетками меланомы и фибробластов. Клетки меланомы, образоваваемые при отсутствии фибробластов, не образуют типичных 3D сфероидов, хотя некоторые клетки меланомы образуют 2D кластеры с расширенной культурой.
Использование промежуток времени изображения, фибробласты и опухолевые клетки могут наблюдаться взаимодействующих в кокультуре, начиная с сфероидов около 36 часов. В этом фильме, динамический процесс одного культурного образования клеток меланомы совокупности от четырех до 52 часов культуры можно наблюдать. Здесь 3D-структуру сфероидов можно наблюдать с помощью конфокальная микроскопия после семи дней культуры, в то время как в этом фильме можно визуализировать 2D-клеточный кластер.
3D сфероиды остаются приостановленными в среде культуры и являются мобильными, в то время как 2D опухолевые клеточные кластеры, как правило, прикрепляются к культурной пластине и неподвижны. Эта 3D-модель служит уникальной платформой для изучения взаимодействий опухоли и стромы. Например, для выяснения того, как межклеточный Notch1 сигнализации пути деятельности и рака связанных фибробластов регулировать стволовых рака и инициирования клеточной и сфероидной формирования.
Кроме того, эта модель может быть использована для проверки реакции препарата рака стволовых и инициируя клетки. Хотя этот метод прост и прямо вперед, позаботьтесь, чтобы использовать правильную плотность клеток и соотношение клеток, и использовать соответствующие пластины культуры, как попродемонстрировано. Эта 3D модель может быть применена либо для усердства важнейших внутриклеточных сигнальных путей для определения фенотипов раковых стволовых клеток, а также скрининга небольших молекул соединений, к которым раковые стволовые клетки очень чувствительны.
