Abbiamo sviluppato un nuovo modello di sferoidi 3D che offre una piattaforma per studiare le interazioni cancro-stroma e testare le terapie contro il cancro. Dal mio punto di vista, questo sistema 3D combina le cellule tumorali in un fibroblasto stroma per imitare meglio le reali condizioni tumorali e può, quindi, essere uno strumento molto potente per la scoperta di farmaci. Inoltre, questo modello non si limita allo studio del Melanoma.
Può essere utilizzato per indagare altri tipi di tumori. A dimostrare la procedura sarà il dottor Hongwei Shao, uno scienziato anziano del mio laboratorio. Per la coltura cellulare del melanoma umano, gettare le cellule in condizioni di coltura cellulare aderente convenzionali e completare il mezzo W489 a 37 gradi celsius in anidride carbonica al 5%.
Quando le celle raggiungono il 90% di confluenza, dividere le celle con un rapporto da uno a cinque. Per la coltura di fibroblasti della pelle di topo, lavare i pellet di tessuto raccolti in PBS prima di coltivare i campioni e DMEM integrati con il 10% di siero bovino fetale e l'uno per cento di penicillina-streptomicina nell'incubatrice di coltura cellulare. Dividi le celle con un rapporto uno a due quando raggiungono una confluenza del 90%.
Prima di impostare le coculture, i fibroblasti di semi su un piatto da 100 millimetri a una concentrazione tale che la confluenza cellulare raggiungerà circa il 60% il giorno successivo. La mattina seguente, sostituire il supernatante con una concentrazione da uno a tre a uno a cinque di GFP al lentivirus diluito dallo stock in un mezzo di coltura regolare integrato con quattro microgrammi per millilitro di polibrene. Posizionare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per sei ore prima di sostituire il supernatante con un mezzo di coltura fresco.
Dopo due giorni, osservare il segnale GFP dalle cellule su un microscopio a fluorescenza. Quando entrambe le colture cellulari sono state trasfette stabilmente, staccare entrambe le colture cellulari da 0,25 tripina-EDTA per raccogliere le sospensioni a singola cellula per centuvazione. Sospendere le cellule a due volte 10-quarta cellule per millilitro della concentrazione media di cocoltura e mescolare le cellule di melanoma e i fibroblasti con un rapporto uno a uno.
Quindi vedere due millilitri di cellule ad ogni pozzo di una piastra di 24 pozza e triplicare per ogni condizione e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per quattro ore per consentire alle cellule di attaccarsi al fondo della piastra. Per la coltura solista della cellula melanoma per valutare la formazione di ammassi cellulari 2D, vedere due volte 10 alla quarta cellula melanoma in ogni pozzo di una piastra di 24 pozzi e coltura delle cellule per sette-10 giorni nell'incubatore di coltura cellulare. Quindi fotografare le cellule su un microscopio a fluorescenza invertito secondo protocolli di microscopia fluorescente standard.
Se il sistema di imaging time lapse è spento, accenderlo almeno un'ora prima dell'imaging. Quando il sistema è pronto, trasferire attentamente la piastra di coltura allo stadio del microscopio e far scorrere l'incubatore e bloccare saldamente la porta. Aprire il software del sistema di imaging time lapse e fare clic su aggiungi contenitore per selezionare il tipo di piastra e il produttore in modo che il microscopio possa localizzare con precisione l'area di scansione.
Selezionare un obiettivo 10 volte superiore e i pozzi di interesse e impostare i parametri per l'area di scansione, il tempo di intervallo tra le scansioni e un tempo di inizio e fine. Quindi registrare l'imaging time lapse da quattro a 52 ore. Al termine della registrazione delle immagini, utilizzare il software del sistema di imaging time lapse per recuperare i dati ed esportare i video o i set di immagini raccolti.
Per l'imaging in microscopia confocale delle coculture, posizionare la piastra sullo stadio di un microscopio a fluorescenza invertita e selezionare i raggi laser rossi e verdi. Osservare le cellule con un obiettivo cinque o dieci volte superiore e selezionare lo sferoide per iniziare la scansione. Utilizzando un micron z-step, eseguire la scansione dal basso verso l'alto dello sferoide.
Quindi elaborare i dati utilizzando il software di elaborazione delle immagini appropriato per ricostruire un'immagine 3D che può essere ulteriormente ruotata e salvata come film 3D. Qui vengono mostrate immagini di sferoidi 3D multicellulari formati da cellule di melanoma cocolturate e fibroblasti. Le cellule di melanoma coltivate in assenza di fibroblasti non formano sferoidi 3D tipici, sebbene alcune cellule di melanoma formino cluster 2D con coltura estesa.
Utilizzando l'imaging time lapse, si possono osservare fibroblasti e cellule tumorali che interagiscono in cocultura, a partire dagli sferoidi a circa 36 ore. In questo filmato, si può osservare il processo dinamico di formazione aggregata di cellule di melanoma singolo coltivato da quattro a 52 ore di coltura. Qui, una struttura sferoide 3D può essere osservata con microscopia confocale dopo sette giorni di coltura, mentre in questo filmato è possibile visualizzare un cluster di cellule 2D.
Gli sferoidi 3D rimangono sospesi nel mezzo di coltura e sono mobili, mentre gli ammassi cellulari tumorali 2D tendono ad attaccarsi alla piastra di coltura e sono immobili. Questo modello 3D funge da piattaforma unica per lo studio delle interazioni tumore-stroma. Ad esempio, per chiarire come l'attività della via di segnalazione notch1 intercellulare e i fibroblasti associati al cancro regolano il gambo del cancro e avviano la formazione di cellule e sferoidi.
Inoltre, questo modello può essere utilizzato per testare le risposte farmacologiche del staminali tumorali e delle cellule di avvio. Sebbene questo metodo sia semplice e diretto, fare attenzione a utilizzare la densità cellulare e il rapporto cellulare corretti e ad utilizzare le piastre di coltura appropriate come dimostrato. Questo modello 3D può anche essere applicato sia per sedare l'attività cruciale della via di segnalazione intracellulare per determinare i fenotipi delle cellule staminali tumorali, sia per lo screening di piccoli composti molecolari a cui le cellule staminali tumorali sono altamente sensibili.
