Используя анализ светового пятна, поведение личинок можно отслеживать до, во время и после входа в светлую область, позволяя анализировать детали движения личинок. Этот анализ прост и прост в работе. Реакция света тестируется только один раз, так что любой возможный эффект световой адаптации может быть исключен.
Чтобы подготовить агар пластины, медленно и равномерно покрыть дно 15 сантиметров Петри блюдо с примерно четыре миллиметра толщиной слой горячей 1%agar. Дайте пластине остыть при комнатной температуре до тех пор, пока агар не затверденет. Чтобы настроить систему визуальной стимуляции, клип подготовленный светодиодный источник света на железный каркас, заботясь о том, что свет проектов вниз к рабочему столу.
Наклоните цилиндр немного, пока угол между плоскости цилиндра и вертикальной плоскости составляет около 10 градусов. Подключите 470 нанометровый синий светодиодный свет к светодиодной штепсельной вилке светодиода высокой мощности и включите драйвер. Поверните ручку в правом верхнем углу водителя, чтобы выбрать канал 470 нанометров и нажмите светодиод.
Когда экран отображает чек, на рабочем столе появится синее светлое пятно. Нажмите OK и поверните ручку, чтобы настроить интенсивность света. Перемести положение источника света вверх и вниз, чтобы скорректировать диаметр светового пятна до двух сантиметров.
Поверните ручку, чтобы выбрать интенсивность света в соответствии с экспериментальными требованиями. Используйте компактную консоль счетчика мощности со стандартным датчиком мощности диода фото для измерения максимальной и минимальной мощности света в месте. Световая сила должна измеряться в темноте в самом эксперименте.
Затем заместить световую силу, измерить ее в три раза и использовать среднее значение. Чтобы настроить воображая систему, зажим высокого разрешения веб-камеры с железным клипом около 10 сантиметров над светлым пятном на рабочем столе и настроить ориентацию объектива камеры к рабочему столу. Подключите камеру к компьютеру под управлением Windows 7 через интерфейс USB и поместите агар-пластину на рабочий стол прямо под камерой.
Откройте программное обеспечение AMCap 9.22, световое пятно будет автоматически показано в окне AMCap. Перемести камеру немного влево или вправо, чтобы убедиться, что световое пятно находится вблизи центра окна. Используйте клип, чтобы исправить 850 плюс-минус три нанометровый фильтр bandpass на пять-семь миллиметров непосредственно под камерой.
Поместите три инфракрасных света генерации светодиодов с центральной длиной волны 850 нанометров равномерно вокруг агар пластины около пяти сантиметров от края пластины и со светодиодными линзами под углом 70 градусов, обращенных к пластине. Затем подключите светодиоды к источнику питания через их кондиционер к преобразователи постоянного тока. В меню программного обеспечения AMCap выберите опции, видео-устройство и формат захвата и установите размер пикселя захваченного видео до 800 на 600, а частоту кадров до 60 кадров в секунду.
Снимите фильтр и поместите линейку под камеру. Отрегулируйте фокус камеры до тех пор, пока линия масштаба не будет ясной и параллельной ширине поля зрения видео и не щелкните захват, настройку и захват видео, чтобы выбрать путь сохранения. Затем нажмите кнопку начать запись, чтобы записать фактическое расстояние, соответствующее 600 пикселей и рассчитать соотношение каждого пикселя к фактическому расстоянию.
Прежде чем ввести личинку в настройку изображения, приобрети короткое видео положения света и назовите нефильтрованную область фонового видео. Поместите фильтр обратно на объектив камеры и включите свет вдали от экспериментального устройства при как низкой настройке, насколько это возможно, в то же время позволяя личинки, чтобы быть четко наблюдается. Используйте ложку, чтобы удалить некоторые личинки из среды культуры и осторожно выбрать третью личинку instar.
Вымойте личинку в дистиллированной воде и поместите личинку в центре агарной пластины. Аккуратно удалите излишки воды из личинки и выключите свет комнаты. Разрешить личинки акклиматизироваться в течение двух минут в темной среде, прежде чем включение инфракрасного светодиодного света.
Следующий эксперимент по избежанию света должен проводиться в темноте. Для удобства демонстрации мы снимали в ярком свете. Аккуратно почистите личинку к центру пластины.
Когда личинка начинает ползать прямо, поверните пластину, чтобы личинка голову к светлому месту. Нажмите захват, настройка и захват видео, чтобы выбрать путь сохранения и нажмите кнопку начала записи для записи. Разрешить личинки ползать к, войти, и оставить световое пятно, пока он почти из поля зрения, и нажмите остановить запись.
Отмести фильтр от камеры и найми короткое видео положения светового пятна. Затем назовите пост продать нефильтрованное видео световой области два и сравнить это видео с областью света одно видео, чтобы гарантировать, что положение светового пятна не изменилось. Здесь можно наблюдать кривые времени скорости хвоста, угол изгиба кузова и угловую скорость изгиба тела репрезентативной личинки.
Размер личинок головы и, следовательно, максимальный угол изгиба тела значительно уменьшается в третьем личинках звезд с октопаминергическими нейронами, ингибируется столбняком токсического выражения по сравнению с родительским контролем, указывающим на то, что нейроны Tdc2-Gal4 необходимы для нормальной реакции личинок света. Для успешной обработки изображений убедитесь, что камера не блокирует свет и что световое пятно круглое и вблизи центра окна. После этой процедуры, оптогенетика может быть выполнена, чтобы наблюдать, как личинки реагируют, когда конкретные нейроны активируются.
Используя этот анализ, детали движения личинок могут быть проанализированы, что позволяет изучить далекое воздействие окружающей среды и внутренних факторов на поведение избегания личинок света.
